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.2014年7月；42(13):8297-309.
doi:10.1093/nar/gku530。 Epub 2014年6月17日。

获得功能的小鼠模型将PRMT6鉴定为NF-κB辅活化子

亚历山德拉·迪洛伦佐 1, 杨延中 1, 马克·马卡卢索 1, 马克·T·贝德福德 2
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获得功能的小鼠模型将PRMT6鉴定为NF-κB辅活化子

亚历山德拉·迪·洛伦佐等。 核酸研究. 2014年7月.

摘要

蛋白精氨酸甲基转移酶6（PRMT6）是一种修饰组蛋白尾部的核酶。为了帮助阐明PRMT6在体内的生物学功能，我们产生了转基因小鼠，该小鼠普遍表达与雌激素受体（ER*）的激素结合部分融合的PRMT6。ER*-PRMT6融合是不稳定的细胞质融合，但经他莫昔芬全身治疗后，它变得稳定并转移到细胞核中。因此，观察到H3R2me2a组蛋白标记显著增加。我们发现诱导ER*-PRMT6激活的一个结果是IL-6水平增加。IL-6的表达受核因子κB（NF-κB）转录因子调节，而PRMT6作为该途径的辅激活剂发挥作用。我们发现PRMT6直接与RelA相互作用，其过表达增强了异位NF-κB报告基因的转录活性，并内源性调节NF-κB靶基因。RelA在TNF-α刺激后将PRMT6招募到选择性NF-κB靶启动子。此外，ER*-PRMT6激活导致RelA在细胞核内积聚。总之，我们观察到PRMT6在选择性NF-κB靶启动子处被招募到染色质中，可能影响组蛋白代码和/或甲基化其他染色质相关蛋白以促进转录。

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数字

图1。
图1。
可诱导ER*-PRMT6融合的特征。(A类)将人PRMT6 cDNA克隆到pCAGGS载体中急诊室*（结合Tamox的雌激素受体的截短版本）。在这两种蛋白质之间引入标记。普遍存在的β-肌动蛋白启动子驱动嵌合ER*-PRMT6蛋白的表达。(B类)这种方法的图形描述。ER*-PRMT6定位于细胞质。在Tamox或OHT处理后，嵌合蛋白变得稳定并转移到细胞核中。(C类)用OHT（2μM）处理稳定转染pCAGGS-ER*-PRMT6的HEK293细胞，然后分离成核[N]和细胞质[C]组分。使用αFlag抗体进行Western分析以检测ER*-PRMT6。进行αLamin A/C Western以确认核质/细胞质分馏的质量。指出OHT治疗后的时间点。(D类)核心组蛋白是从（C）所示的相同ER*-PRMT6 HEK 293细胞中分离出来的。用αH3R2me2a抗体对核心组蛋白进行western分析，以监测该标记的积累。通过Ponceau染色和αH3 western分析证实了等负荷。
图2。
图2。
可诱导ER*-PRMT6融合是功能性的体内. (A类)使用pCAGGS-ER*-PRMT6载体建立了三个转基因株系。用PRMT6 cDNA探针进行Southern分析。箭头表示转基因。(B类)连续5天腹腔注射1mg Tamox，诱导A系小鼠肺、脑和肝中ER*-PRMT6的稳定。车辆（葵花籽油）作为对照注入。(C类)如果在转基因A系小鼠的皮肤切片上进行Flag-tag，则在将Tamox局部涂抹在剃光的背部皮肤上（1 mg/天）5天时，显示ER*-PRMT6在细胞核中稳定。(D类)从局部Tamox处理的小鼠的表皮刮伤中分离核心组蛋白（每隔一天1 mg，持续10周），并用αH3R2me2a抗体进行WB。(E类)ER*-PRMT6 A系小鼠因长期服用Tamox而死亡。在局部给予Tamox（1 mg/天）直到所有转基因小鼠死亡后，生成存活曲线(n个= 14). WT小鼠未受到该治疗的影响。(F类)用ELISA法测定四组动物（WT、WT Tamox处理的、转基因（Tg）A系和Tg A系Tamox治疗的）12次局部应用Tamox（1 mg/d）后的血清IL-6水平。威尔科克斯和学生t吨-测试已运行，并且P（P）Tg-Tamox治疗组的值为0.004(n个=32）与WT Tamox治疗组相比(n个=20）。本研究中的所有小鼠在采集血清时都是健康的。所有小鼠的年龄均在8至9周龄之间，雌雄鼠的比例相等。
图3。
图3。
RelA与内源性PRMT6共免疫沉淀并直接相互作用在体外. (A类)从WT和ER*-PRMT6 Line A小鼠中分离出初级MEF，培养7天并用OHT（2μM）处理24小时。然后用αFlag琼脂糖裂解细胞并进行IP。使用αRelA抗体的WB揭示了ER*-PRMT6和转基因细胞裂解液中内源性RelA之间的相互作用。(B类)HEK 293细胞生长至90%汇合，然后用PBS洗涤并在co-IP缓冲液中溶解。将裂解液等量分开，与αIgG或αPRMT6抗体孵育过夜，然后与蛋白A/G琼脂糖孵育。使用αRelA抗体的WB显示PRMT6和RelA之间的相互作用。(C类)永生WT和PRMT6-KO MEF生长到90%的汇合处，然后用PBS洗涤并在co-IP缓冲液中溶解。将裂解产物与αPRMT6抗体（识别小鼠PRMT6）孵育过夜，然后与蛋白A/G琼脂糖孵育。使用αRelA抗体的WB显示了WT细胞中PRMT6和RelA之间的相互作用。(D类)PRMT6和RelA之间的直接绑定。GST和GST-RelA（1-431）与His-PRMT6孵育，并进行GST下拉。对于另一个阴性对照，GST-RelA也与His-Tudor-UHRF1一起孵育。使用αHis抗体的WB显示GST-RelA和His-PRMT6之间的直接结合。
图4。
图4。
PRMT6是一个NF-κB辅活化子。(A类)用NF-κB萤火虫荧光素酶报告质粒和Renilla荧光素素酶构建物以及GFP载体（Mock）、GFP-CARM1或GFP-PRMT6构建物瞬时共转染HEK 293细胞。在转染TNF-α（10 ng/ml，6 h）后20 h，细胞未受刺激或受刺激。误差条表示根据四份萤光素酶测定计算的标准偏差。平均值表示为荧光素酶活性的折叠变化，未刺激Mock任意设置为1。这个P（P）与Mock相比，PRMT6和CARM1转染获得的值分别为0.00016和0.0012。这些数据代表了四个独立的实验。(B类)HEK 293细胞与NF-κB荧光素酶报告质粒和Renilla荧光素酶构建物以及空载体或pMyc-PRMTT6或PRMT6催化非活性形式（死亡）瞬时共转染。在用TNF-α（10ng/ml，6h）转染后20小时不刺激或刺激细胞。误差条表示根据四次荧光素酶分析计算的标准偏差。平均值表示为荧光素酶活性的折叠变化，未刺激Mock任意设置为1。这个P（P）与模型相比，经TNF-α处理的PRMT6 WT组和死酶组的值分别为0.0006和0.43。(C类)用GFP（Mock）、GFP-PRMT6或GFP-CARM1构建物转染HeLa细胞24 h，然后用TNF-α刺激（10 ng/ml，60 min）。通过定量RT-PCR分析总RNA的指示基因的表达，并针对GAPDH进行标准化。对于每个基因，TNF-α刺激的模拟组平均值被任意设置为1。误差条表示从三倍计算的标准偏差。对于白细胞介素-6，的P（P）GFP-PRMT6和GFP-CARM1相对于模拟的值分别为0.005和0.0004。对于肿瘤坏死因子-α，的P（P）GFP-PRMT6和GFP-CARM1相对于模型的值分别为9.2E-07和0.002。对于MCP1（MCP1），的P（P）GFP-PRMT6和GFP-CARM1相对于模拟的值分别为0.3和0.07。对于环氧化酶-2，的P（P）GFP-PRMT6和GFP-CARM1相对于模型的值分别为5.8E-05和0.64。(D类)WT和PRMT6-KO永生化Mefs生长到90%的汇合点，此时细胞未受TNF-α刺激或受TNF--α刺激（10 ng/ml，60 min）。分离总RNA并通过定量RT-PCR分析IL-6基因的表达，并根据GAPDH标准化。误差条表示从三倍计算的标准偏差。未模拟组的平均值被任意设置为1。这个P（P）对于WT和KO细胞，TNF-α刺激组与未刺激组相比的值分别为0.0002和0.0024。这个P（P）KO和WT电池的折减差值为0.0014。
图5。
图5。
PRMT6在NF-κB调节启动子的一个子集促进RelA穿梭进入细胞核和ChIPs。(A类)从WT和ER*-PRMT6小鼠中分离出初级MEF，培养3天并用OHT处理2周。进行细胞分离。对Flag-tag的西方分析表明，ER-PRMT6在核馏分中稳定，对应于核RelA的增加。细胞质提取物上RelA和IκB-α的WB显示这两种蛋白的水平没有变化。(B类)在HeLa细胞中瞬时转染GFP-PRMT6后，使用αRelA抗体进行免疫荧光显示转染细胞中的核RelA增加。使用GFP表达结构作为阴性对照。(C类)用GFP或GFP-PRMT6表达载体瞬时转染HeLa细胞24小时，此时细胞未经处理或用TNF-α处理（10 ng/ml，30分钟）。在κB共识区域的ChIP分析白细胞介素-6然后使用αRelA抗体执行启动子。将数值标准化为上游8000 bp的基因间区域白细胞介素-6共识序列。对于每次转染，未刺激组的平均值被任意设置为1。误差条表示从三等分计算得到的标准偏差。这个P（P）对于转染GFP-PRMT6的细胞，TNF-α刺激组与未刺激组相比的值分别为0.0024和0.0003。这个P（P）PRMT6过度表达细胞与模拟细胞的倍增差值为0.023。(D类)HeLa细胞生长到90%的汇合点，此时细胞未经处理或用TNF-α处理（10 ng/ml，30 min）。在κB共识区域的ChIP分析白细胞介素-6,肿瘤坏死因子-α和IκB-α然后使用αPRMT6抗体执行启动子。将数值标准化为上游8000 bp的基因间区域白细胞介素-6共识序列。误差条表示从三倍计算的标准偏差。未刺激组的平均值被任意设置为1。这个P（P）TNF-α刺激组与未刺激组相比的数值分别为0.024、0.0053和0.84白细胞介素-6,肿瘤坏死因子-α和IκB-α基因。(E类)通过ChIP/re-ChIP实验评估PRMT6和RelA在IL-6启动子共识区的募集情况。HeLa细胞未经刺激或用TNF-α处理（10 ng/ml，30 min），然后使用指示的抗体进行ChIP/re-ChIP实验。用IL-6共有区引物对ChIP DNA进行qPCR分析。(F类)使用对照组和RelA敲低HeLa细胞的αPRMT6抗体进行ChIP实验，这些细胞要么不受刺激，要么用TNF-α处理。
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