Peripheral benzodiazepine receptor/translocator protein global knock-out mice are viable with no effects on steroid hormone biosynthesis

doi:10.1074/jbc.M114.578286

.2014年10月3日；289(40):27444-54.

doi:10.1074/jbc。M114.578286。 Epub 2014年6月16日。

外周苯二氮卓受体/转运体蛋白全球敲除小鼠存活，对类固醇激素生物合成无影响

兰娜图¹, 卡纳科·莫罗哈库¹, 普拉克·R·曼纳², 苏珊娜·佩尔顿¹, 罗纳德·巴特勒¹, 道格拉斯·M·斯托科², 维姆尔·塞瓦拉吉^三

附属公司

¹来自纽约州伊萨卡市康奈尔大学农业与生命科学学院动物科学系，邮编：14853。
²德克萨斯州立大学医学院细胞生物学和生物化学系，德克萨斯州卢伯克市德克萨斯理工大学健康科学中心，邮编79430。
^三来自纽约州伊萨卡市康奈尔大学农业与生命科学学院动物科学系，邮编：14853vs88@cornell.edu。

PMID： 24936060
预防性维修识别码：项目经理4183784
内政部： 10.1074/jbc。M114.578286号

外周苯二氮卓受体/转运体蛋白全球敲除小鼠存活，对类固醇激素生物合成无影响

兰娜图等。生物化学杂志. 2014.

.2014年10月3日；289(40):27444-54.

doi:10.1074/jbc。M114.578286。 Epub 2014年6月16日。

作者

兰娜图¹, 卡纳科·莫罗哈库¹, 普拉克·R·曼纳², 苏珊娜·佩尔顿¹, 罗纳德·巴特勒¹, 道格拉斯·M·斯托科², 维姆尔·塞瓦拉吉^三

附属公司

¹来自纽约州伊萨卡市康奈尔大学农业与生命科学学院动物科学系，邮编：14853。
²德克萨斯州立大学医学院细胞生物学和生物化学系，德克萨斯州卢伯克市德克萨斯理工大学健康科学中心，邮编79430。
^三来自纽约州伊萨卡市康奈尔大学农业与生命科学学院动物科学系，邮编：14853vs88@cornell.edu。

PMID： 24936060
预防性维修识别码：项目经理4183784
内政部： 10.1074/jbc。M114.578286号

摘要

转运蛋白（TSPO），以前被称为外周苯二氮卓类受体，是一种线粒体外膜蛋白，与胆固醇输入线粒体内膜（类固醇激素生物合成的限速步骤）有关。此前对TSPO的研究完全基于体外实验，早期的一份报告称TSPO基因敲除小鼠具有胚胎致死性，进一步证实了TSPO的关键作用。在之前的一篇文章中，我们检测了Leydig细胞特异性TSPO条件敲除小鼠，这表明TSPO在体内不需要产生睾酮。这引发了关于TSPO功能的争议和几个问题。为了研究TSPO在类固醇生成和胚胎发育中的决定性作用，我们建立了TSPO全失活（TSPO（-/-））小鼠。与早期报告相反，Tspo（-/-）小鼠存活下来，没有明显的表型异常，并且可以生育。对Tspo（-/-）小鼠肾上腺和性腺类固醇生成的检查显示没有缺陷。基因表达谱的肾上腺转录组比较表明，参与类固醇激素生物合成的基因（Star、Cyp11a1和Hsd3b1）在Tspo（-/-）小鼠中没有变化。Tspo（-/-）小鼠肾上腺皮质超微结构无形态学改变。为了将我们的体内研究结果与之前使用的体外模型相关联，我们还确定，siRNA敲除或不同小鼠和人类类固醇生成细胞系中TSPO的缺失对类固醇的生成没有影响。这些发现直接驳斥了TSPO对类固醇激素的生物合成和活性不可或缺的教条。通过修正现有模型，本研究提高了我们对类固醇生成的理解，在生物学和医学中具有广泛的意义。

关键词：肾上腺；胆固醇；基因敲除；线粒体；STAR；类固醇生成；TSPO。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**TSPO敲除小鼠的产生。** *A、，*基因组示意图*Tspo公司*野生型基因座(*Tspo公司*^+/+)，完整的丝线(*Tspo公司^{飞行/飞行}*)和淘汰赛(*Tspo公司*^−/−)老鼠。*Tspo公司^{飞行/飞行}*小鼠包含外显子2和外显子3，外显子两侧有LoxP位点(*开放箭头*).Tspo公司^{飞行/飞行}雌性小鼠与*Ddx4-芯*雄性小鼠产生生殖细胞特异性缺失的TSPO为杂合子。这些精子和卵母细胞特异性敲除小鼠是为了产生*Tspo公司*^−/−后代。*Ddx4-芯*转基因随后从这个群体中培育出来。*B、，*显示floxed等位基因和*cre公司*转基因*Ddx4-芯*老鼠，*Tspo公司^{飞行/飞行}*老鼠，*Tspo公司*^+/− *Ddx4-芯*老鼠，*Tspo公司*^−/− *Ddx4-芯*老鼠，和*Tspo公司*^−/−老鼠。*C、，*基因组DNA PCR用于重组*Tspo公司*基因座检测基因外显子2和3的缺失*Tspo公司*^−/−小鼠（产品大小：Flox-2697 bp、Null-872 bp和Con-161 bp）。

**图2。**
**的验证*Tspo公司*^−/−基因型。** *A、 Tspo公司^{飞行/飞行}*-ROSA26-td番茄报告小鼠用于检测生殖细胞特异性缺失在后代中诱导的cre介导的重组。R26-tdTom中的全局重组是明确的-*Tspo公司*^−/−P3幼崽。*B、，*TSPO单克隆抗体针对TSPO外显子4对应的肽检测到一个预期大小（18kDa）的蛋白*Tspo公司^{飞行/飞行}*组织，但不在*Tspo公司*^−/−组织。ACTB和线粒体异柠檬酸脱氢酶2作为对照。*比例尺，*1厘米。*C、，*R26-tdTom不同组织的代表性图像-*Tspo公司^{飞行/飞行}*与R26-tdTom组织相比，没有tdTomato荧光的小鼠-*Tspo公司*^−/−显示td番茄荧光的小鼠(红色)指示重组。用DAPI对细胞核进行复染(蓝色).比例尺，50微米。

**图3。**
**TSPO缺失不影响性腺类固醇生成。** *A、，*睾丸切片显示TSPO在Leydig和Sertoli细胞中的定位*Tspo公司^{飞行/飞行}*但不在*Tspo公司*^−/−睾丸。生精小管的功能形态学在*Tspo公司*^−/−睾丸。*B、，*卵巢切片显示TSPO定位于间质细胞和表面上皮，弱于卵泡膜和颗粒细胞*Tspo公司^{飞行/飞行}*卵巢；未观察到染色*Tspo公司*^−/−卵巢。功能形态在*Tspo公司*^−/−卵巢。*C、，*基线血浆睾酮水平在*Tspo公司^{飞行/飞行}*和*Tspo公司*^−/−雄性小鼠(n个=24–25/组）。*D、，*人绒毛膜促性腺激素刺激后血浆睾酮水平的增加与*Tspo公司^{飞行/飞行}*和*Tspo公司*^−/−雄性小鼠(n个=6–7/组）。*E中，*基线血浆雌二醇水平在*Tspo公司*^−/−与…相比*Tspo公司^{飞行/飞行}*老鼠(第页<0.05），但差异不大(n个=12–15/组）。*F、，*基线血浆孕酮水平在*Tspo公司^{飞行/飞行}*和*Tspo公司*^−/−老鼠(n个=12–15/组）。*比例尺，*200微米。

**图4。**
**TSPO缺失对肾上腺皮质的形态和脂质沉积没有影响。** *A、，*肾上腺切片*Tspo公司^{飞行/飞行}*和*Tspo公司*^−/−TSPO定位于肾小球带高密度肾上腺皮质细胞的小鼠；未观察到染色*Tspo公司*^−/−肾上腺。两种基因型的肾上腺皮质形态无明显差异。*B、，*肾上腺油红O染色显示中性脂质沉积在*Tspo公司^{飞行/飞行}*和*Tspo公司*^−/−肾上腺。*C、，*油红O的定量(*ORO公司*)两者的标记密度相似*Tspo公司^{飞行/飞行}*和*Tspo公司*^−/−肾上腺皮质(n个=5/组；平均值±S.E.）。*比例尺，*200微米。

**图5。**
**TSPO缺失对肾上腺类固醇激素的产生没有影响。** *A、，*血浆醛固酮基线水平在*Tspo公司^{飞行/飞行}*和*Tspo公司*^−/−老鼠(n个=7/组）。*B、，*血浆皮质酮基线水平在*Tspo公司^{飞行/飞行}*和*Tspo公司*^−/−老鼠(n个=24-30/组）。*C、，*ACTH刺激后血浆皮质酮的增加与*Tspo公司^{飞行/飞行}*和*Tspo公司*^−/−老鼠(n个=10–14/组）。*D、，*典型的Western blot显示，ACTH刺激后STAR和TSPO蛋白表达无代偿性增加*Tspo公司^{飞行/飞行}*和*Tspo公司*^−/−老鼠。STAR的量化(E类)和TSPO(F类)在促肾上腺皮质激素刺激后1小时，蛋白质水平也没有显著增加(n个= 3).A.U.公司。，任意单位。数据表示为平均值±S.E。

**图6。**
**TSPO缺失不会改变肾上腺中类固醇生成基因和TSPO相互作用蛋白的表达水平。**类固醇生成基因的表达水平星星(A类),*Cyp11a1细胞*(B类)、和*Hsd3b1型*(C类)两者之间相似*Tspo公司^{飞行/飞行}*和*Tspo公司*^−/−老鼠。*Tspo2公司*表达式(天)在两个中都未检测到*Tspo公司^{飞行/飞行}*和*Tspo公司*^−/−肾上腺。编码TSPO相互作用蛋白的基因*Vdac1型*(E类),*Vdac2型*(F类),*Vdac3型*(*G公司*),*蚂蚁1*(*H（H）*),*蚂蚁2*(我),*Hxk2型*(J型),*第7页*(*K（K）*)、和*Acbp公司*(*L（左）*)显示出相似的表达水平*Tspo公司^{飞行/飞行}*和*Tspo公司*^−/−老鼠。*Tspo公司*表达式(*M（M）*)在中未检测到*Tspo公司*^−/−肾上腺(n个=6/组）。数据表示为平均值±S.E。*ACBP公司*，酰基辅酶A结合蛋白；*ND（无损检测）*，未检测到。

**图7。**
**肾上腺皮质细胞的超微结构不受TSPO缺失的影响。**显示肾小球带细胞形态的透射电镜照片(A类)和网状带(B类)肾上腺皮质。亚细胞器形态，包括线粒体和脂滴，两者之间是相同的*Tspo公司^{飞行/飞行}*和*Tspo公司*^−/−老鼠。

**图8。**
**类固醇生成细胞中TSPO的敲除并不影响类固醇激素的生物合成。**与MA-10中的对照组（打乱）相比，TSPO敲除（1和2）导致TSPO蛋白显著减少(A类)，Y1(B类)、MLTC(天)、和R2C细胞(E类). H295R细胞中未检测到基线TSPO(C类). Bt公司₂cAMP处理导致MA-10、Y1、MLTC和H295R细胞中STAR蛋白表达增加，孕酮生成增加。TSPO敲除MA-10细胞的孕酮生成显著增加(第页<0.05）。TSPO敲除Y1细胞和MLTC细胞中的孕酮生成与扰乱对照相似。H295R细胞未显示TSPO表达，但在Bt后仍产生孕酮₂cAMP治疗。仔细的复查证实H295R细胞不表达TSPO蛋白和mRNA(F类和*G公司*). 异常R2C细胞组成性表达高STAR蛋白水平，并持续产生高水平孕酮。R2C中TSPO的敲除导致孕酮产生适度但具有统计学意义的下降(第页<0.05），无论是否使用Bt₂cAMP治疗。

**图9。**
**TSPO表达无等位基因特异性。** *A、，*TSPO单克隆抗体在*Tspo公司^{飞行/飞行}*母系遗传杂合子*Tspo公司*^+/−和父系遗传杂合子*Tspo公司*^+/−; 在中未检测到TSPOTspo公司^−/−肾上腺。*B、，*在*Tspo公司*mRNA表达水平介于*Tspo公司^{飞行/飞行}*和母体杂合子*Tspo公司*^+/−肾上腺；不*Tspo公司*mRNA在*Tspo公司*^−/−肾上腺(n个=4/组；ND*，未检测到）。

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