An electrically tight in vitro blood-brain barrier model displays net brain-to-blood efflux of substrates for the ABC transporters, P-gp, Bcrp and Mrp-1

doi:10.1208/s12248-014-9628-1

.2014年9月；16(5):1046-55.

doi:10.1208/s12248-014-9628-1。 Epub 2014年6月17日。

电紧密体外血脑屏障模型显示ABC转运体、P-gp、Bcrp和Mrp-1底物的净脑血流出

汉斯·克里斯蒂安·赫尔姆斯¹, 玛丽亚·赫索姆, 路易丝·博雷拉·库尔曼, 拉西娜·巴多洛, 卡斯滕·乌德·尼尔森, 伯格·布罗丁

附属公司

PMID： 24934296
预防性维修识别码：项目经理4147044
内政部： 10.1208年/12248-014-9628-1年

电紧密体外血脑屏障模型显示ABC转运体、P-gp、Bcrp和Mrp-1底物的净脑血流出

汉斯·克里斯蒂安·赫尔姆斯等。 AAPS J公司. 2014年9月.

.2014年9月；16(5):1046-55.

doi:10.1208/s12248-014-9628-1。 Epub 2014年6月17日。

作者

汉斯·克里斯蒂安·赫尔姆斯¹, 玛丽亚·赫索姆, 路易丝·博雷拉·库尔曼, 拉西娜·巴多洛, 卡斯滕·乌德·尼尔森, 伯格·布罗丁

附属

¹哥本哈根大学健康与医学院药学系，丹麦哥本哈根大学帕肯2号，2100。

PMID： 24934296
预防性维修识别码：项目经理4147044
内政部： 10.1208/s12248-014-9628-1

摘要

ATP-结合盒超家族的外流转运体包括乳腺癌耐药蛋白（Bcrp/Abcg2）、P-糖蛋白（P-gp/Abcb1）和多药耐药相关蛋白（Mrp’s/Abcc’s）在血脑屏障（BBB）中表达。本研究的目的是研究牛内皮细胞/大鼠星形胶质细胞体外BBB共培养模型是否显示已知外排转运体底物的极化运输。共培养模型显示甘露醇渗透率为0.95±0.1·10（-6）cm·s（-1），内皮细胞电阻为1177±101Ω·cm（2）。用（3）H-地高辛、（3）8-雌酮-3-硫酸盐和（3）H-依托泊苷进行的双向转运研究表明，极化转运有利于所有底物的脑血方向。地高辛、硫酸雌酮和足叶乙甙的稳态流出比分别为2.5±0.2、4.4±0.5和2.4±0.1。通过添加维拉帕米（地高辛）、Ko143（雌酮-3-硫酸酯）或唑喹达尔+逆转剂（足叶乙甙），这些浓度分别降至1.1±0.08、1.4±0.2和1.5±0.1。在外流转运体抑制剂维拉帕米、Ko143、zosuquidar、reversan和MK 571单独或联合存在的情况下，研究所有底物的脑血通透性。地高辛主要通过P-gp、雌酮-3-硫酸酯通过Bcrp、Mrp和足叶乙甙通过P-gp和Mrp进行转运。免疫细胞化学证实了P-gp，Bcrp和Mrp-1的表达。研究结果表明，P-gp、Bcrp和至少一种Mrp亚型在我们的牛/大鼠共培养模型中有功能性表达，该模型适用于小分子转运的研究。

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数字

图1
免疫细胞化学特征*在体外*共同培养第6天的血脑屏障模型。上排内皮细胞用Alexa-488阴茎倍体蛋白染色以显示丝状肌动蛋白(一)带有抗von Willebrand因子的抗体(b条)或抗神经胶质原纤维酸性蛋白的抗体(**c（c）**) (绿色). 细胞核用碘化丙啶复染(红色).下一行Alexa-488卵磷脂染色的星形胶质细胞(d日)，一种针对von Willebrand因子的抗体(电子)或抗神经胶质原纤维酸性蛋白的抗体(**（f）**) (绿色).酒吧 = 20微米

图2
共同培养单层细胞的TEER随实验时间的变化。TEER在37°C下测量，以避免每次测量前细胞冷却。共同培养物或与培养基一起培养(*实心正方形*)或在HBSS中使用10 mM HEPES和0.5%BSA(*实心圆*). 两个系列中的第一个数据点对应于37°C培养基中的初始TEER测量。在初始TEER测量后，一个治疗组的培养基被HBSS替换，并且在搅拌开始前15分钟培养两组。搅拌在时间零点开始。数据为平均值 ± 扫描电镜(n个 = 3–4,N个 = 2–3)

图3
甘露醇渗透率与TEER的关系。表观甘露醇渗透率¹⁴C–D-甘露醇（20μM）在单个过滤器插入物上的通量实验，绘制为实验前在室温下测量的相应过滤器插入物的跨内皮电阻的函数

图4
经内皮转运^三地高辛（0.03μM）(一),^三3-硫酸氢雌酮(b条)（0.02μM）和^三H-依托泊苷(**c（c）**)（2.64μM）作为时间的函数在共培养模型中(*实心三角形*)和光-光方向(*实心圆*)无抑制剂或有抑制剂（管腔对管腔，*开口三角形*; 铝-铝-铝，开环)，维拉帕米（50μM）(一)，Ko 143（0.5μM）(b条)或是佐苏基达尔 + reversan（分别为0.5和5μM）(**c（c）**). 数据是手段 ± 扫描电镜(n个 = 3–9,N个 = 2–3）

图5
根据表观基质渗透率得出的流出比。抑制剂的浓度为50μM（维拉帕米）、5μM（reversan）或0.5μM（Ko 143和zosuquidar）。数据是手段 ± 扫描电镜(n个 = 3–25,N个 = 2–3).**P（P）* < 0.05, *****P（P）* < 0.0001

图6
消融-腔传输^三地高辛（0.03μM）(一),^三3-硫酸氢雌酮(b条)（0.02μM）和^三H-依托泊苷(**c（c）**)（2.64μM）。抑制剂的浓度为50μM（维拉帕米和MK 571）、5μM（reversan）或0.5μM（Ko 143和zosuquidar）。在相同的实验中，针对无抑制剂的基质渗透率对数据进行标准化，并显示为平均值 ± 扫描电镜(n个 = 3–4,N个 = 2–3). ***P（P）* < 0.01, ****P（P）* < 0.001, *****P（P）* < 0.0001

图7
牛脑内皮细胞中P-糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐药蛋白（Bcrp）和多药耐药相关蛋白-1（Mrp-1）的免疫细胞化学染色：新鲜分离的牛脑毛细血管(一——**c（c）**)与内皮细胞共培养6天后(d日——我)与P-糖蛋白抗体一起孵育(一,d日,克)，乳腺癌抵抗蛋白(b条,电子,小时)或多药耐药性相关蛋白-1(**c（c）**,**（f）**,我)然后用标记有Alexa-488的物种特异性二级抗体孵育(绿色). 所有样本均与碘化丙啶孵育以观察细胞核(红色).酒吧 = 20微米(一——**（f）**)或5μm(克——我)

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