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.2014年7月15日；22(14):3753-72.
doi:10.1016/j.bmc.2014.04.049。 Epub 2014年5月14日。

水溶性4-取代-2,6-二甲基呋喃[2,3-d]嘧啶作为多靶向受体酪氨酸激酶抑制剂和微管靶向抗肿瘤药物的设计和发现

张欣 1, 苏迪尔·拉加万 1, 迈克尔·伊纳特 2, 杰西卡·索普 2, Bryan C排放 2, 安贾·巴斯蒂安 2, Lora C Bailey-Downs公司 2, 尼古拉斯·F·迪巴达尔·哈格里夫斯（Nicholas F Dybdal-Hargreaves） 三, 克里斯蒂娜·罗赫纳 三, 欧内斯特·哈默尔 4, 苏珊·穆贝里 三, 阿莱姆·冈吉 5
附属机构

水溶性4-取代-2,6-二甲基呋喃[2,3-d]嘧啶作为多靶向受体酪氨酸激酶抑制剂和微管靶向抗肿瘤药物的设计和发现

张欣（Xin Zhang）等。 生物医药化学. .

摘要

报道了14种4-取代2,6-二甲基呋喃[2,3-d]嘧啶的设计、合成和生物学评价。四种化合物（11-13，15）抑制血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）、血小板衍生生长因子受体β（PDGFR-β）和靶向微管蛋白，导致细胞毒性。化合物11对过度表达VEGFR-2和PDGFR-β的肿瘤细胞株具有纳米级效力，与舒尼替尼和赛美昔尼相当。此外，11结合在微管蛋白的秋水仙碱位点，解聚细胞微管并抑制纯化的微管蛋白组装，克服βIII-微管蛋白和P-糖蛋白介导的耐药性，并启动有丝分裂阻滞导致细胞凋亡。在体内，其盐酸盐21在异种移植和同种移植小鼠模型中减小了肿瘤大小和血管，并且优于多西他赛和舒尼替尼，没有明显毒性。因此，21提供了单一药物中潜在的联合化疗。

关键词：抗癌药物；微管靶向剂；单药联合化疗；酪氨酸激酶抑制剂。

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数字

图1
图1
微管靶向剂的结构。
图2
图2
a。ATP与RTK的结合。显示了来自VEGFR-2和PDGFR-βATP位点中四个结合囊（铰链区、疏水囊I、疏水囊II和磷酸盐位点）的代表性氨基酸以及与ATP的潜在相互作用。ATP的潜在相互作用图是使用MOE 2010.10通过将ATP在VEGFR-2（PDB:1YWN）中的停靠姿势和PDGFR-β的同源模型叠加而生成的。b。建议的水平绑定模式1/11，RTK类似于ATP绑定模式。c。建议采用11个RTK的替代垂直绑定模式。
图2
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a。ATP与RTK的结合。显示了来自VEGFR-2和PDGFR-βATP位点中四个结合囊（铰链区、疏水囊I、疏水囊II和磷酸盐位点）的代表性氨基酸以及与ATP的潜在相互作用。ATP的潜在相互作用图是使用MOE 2010.10通过将ATP在VEGFR-2（PDB:1YWN）中的停靠姿势和PDGFR-β的同源模型叠加而生成的。b。建议的水平绑定模式1/11，RTK类似于ATP绑定模式。c。建议采用11个RTK的替代垂直绑定模式。
图2
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a。ATP与RTK的结合。显示了来自VEGFR-2和PDGFR-βATP位点中四个结合囊（铰链区、疏水囊I、疏水囊II和磷酸盐位点）的代表性氨基酸以及与ATP的潜在相互作用。ATP的潜在相互作用图是使用MOE 2010.10通过将ATP在VEGFR-2（PDB:1YWN）中的停靠姿势和PDGFR-β的同源模型叠加而生成的。b。建议的水平绑定模式1/11，RTK类似于ATP绑定模式。c。建议采用11个RTK的替代垂直绑定模式。
图3
图3
单药抗肿瘤蛋白和RTK抑制活性的设计。
图4
图4
furo[2,3的结构-d日]嘧啶RTK抑制剂3–15。
图5
图5
缺乏2-甲基的激酶抑制剂的结构。
图6
图6
化合物11在微管蛋白秋水仙素位点的对接：11（粉红色）和DAMA秋水仙碱（紫色；袖珍氨基酸用绿色表示为棒状。PDB:1SA0。
图7
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化合物21诱导G细胞周期阻滞2/M期和凋亡类似于CA-4。用载体（A）、25 nM CA-4（B）、40 nM 11（C）、50 nM 11。从用载体、50nM CA-4、75nM 11或120nM 21处理18或36小时的MDA-MB-435细胞制备全细胞蛋白裂解物，并进行蛋白质印迹以确定裂解的PARP（G）的水平。肌动蛋白被用作加载控制。a。11在VEGFR-2和PDGFR-β的ATP结合位点对接：11（粉红色）在VEGFR-2（PDB:1YWN）的ATP结合囊中以垂直结合模式对接。袖珍氨基酸用绿色表示为棒状。口袋中与11形成最强相互作用的氨基酸以绿色表示为圆柱体。b。在VEGFR-2（PDB:1YWN）的假定ATP绑定袋中，以类似ATP的水平绑定模式停靠11个（粉红色）姿势。袖珍氨基酸用绿色表示为棒状。口袋中与11形成最强相互作用的氨基酸被描述为绿色圆柱体。
图7
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化合物21诱导G细胞周期阻滞2/M期和凋亡类似于CA-4。用载体（A）、25 nM CA-4（B）、40 nM 11（C）、50 nM 11。用载体、50 nM CA-4、75 nM 11或120 nM 21处理18或36 h的MDA-MB-435细胞制备全细胞蛋白裂解物，并进行Western blotting以确定裂解PARP（G）的水平。肌动蛋白被用作加载控制。a。11在VEGFR-2和PDGFR-β的ATP结合位点对接：11（粉红色）在VEGFR-2（PDB:1YWN）的ATP结合囊中以垂直结合模式对接。袖珍氨基酸用绿色表示为棒状。口袋中与11形成最强相互作用的氨基酸以绿色描绘为圆柱体。b。在VEGFR-2（PDB:1YWN）的假定ATP绑定袋中，以类似ATP的水平绑定模式停靠11个（粉红色）姿势。袖珍氨基酸用绿色表示为棒状。口袋中与11形成最强相互作用的氨基酸被描述为绿色圆柱体。
图7
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化合物21诱导G细胞周期阻滞2/M期和凋亡类似于CA-4。用载体（A）、25 nM CA-4（B）、40 nM 11（C）、50 nM 11。用载体、50 nM CA-4、75 nM 11或120 nM 21处理18或36 h的MDA-MB-435细胞制备全细胞蛋白裂解物，并进行Western blotting以确定裂解PARP（G）的水平。肌动蛋白被用作加载控制。a。11在VEGFR-2和PDGFR-β的ATP结合位点对接：11（粉红色）在VEGFR-2（PDB:1YWN）的ATP结合囊中以垂直结合模式对接。袖珍氨基酸用绿色表示为棒状。口袋中与11形成最强相互作用的氨基酸以绿色表示为圆柱体。b。在VEGFR-2（PDB:1YWN）的假定ATP绑定袋中，以类似ATP的水平绑定模式停靠11个（粉红色）姿势。袖珍氨基酸用绿色表示为棒状。口袋中与11形成最强相互作用的氨基酸被描述为绿色圆柱体。
图8
图8
在MDA-MB-435侧翼异种移植物模型中，用21治疗降低了原发性肿瘤生长和肿瘤血管密度。将500000个MDA-MB-435细胞植入NCr无胸腺nu/nu小鼠的侧翼，并在肿瘤植入后2周的MTD开始，每周两次用载体、多西他赛、舒尼替尼和21进行治疗，直到实验结束。数据代表6-8只动物。（A） 肿瘤体积采用椭球体公式计算：体积=0.52（长×宽×深），以植入后天数表示。（B） 实验结束时，用CD31/PECAM-1抗体和Vectastain ABC试剂盒对肿瘤切片进行染色，以检测肿瘤血管密度。通过计数CD31阳性血管来确定血管密度，并以载体治疗动物的血管密度百分比表示。（C） 通过在实验开始和结束时测量动物体重确定的动物体重变化百分比的图形表示。a。PDGFR-β同源模型中假定ATP结合囊中垂直结合模式下11（粉红色）的对接姿势。袖珍氨基酸用绿色表示为棒状。口袋中与11形成最强相互作用的氨基酸被描绘成绿色圆柱体。b。在PDGFR-β同源模型的假定ATP结合囊中，11（粉红色）以类ATP水平结合模式对接。袖珍氨基酸用绿色表示为棒状。口袋中与11形成最强相互作用的氨基酸被描述为绿色圆柱体。
图8
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在MDA-MB-435侧翼异种移植模型中，21次治疗降低了原发性肿瘤生长和肿瘤血管密度。将500000个MDA-MB-435细胞植入NCr无胸腺nu/nu小鼠的侧翼，并在肿瘤植入后2周的MTD开始，每周两次用载体、多西他赛、舒尼替尼和21进行治疗，直到实验结束。数据代表6-8只动物。（A） 肿瘤体积采用椭球公式计算：体积=0.52（长×宽×深），并以植入后天数表示。（B） 实验结束时，用CD31/PECAM-1抗体和Vectastain ABC试剂盒对肿瘤切片进行染色，以检测肿瘤血管密度。通过计数CD31阳性血管来确定血管密度，并以载体治疗动物的血管密度百分比表示。（C） 通过在实验开始和结束时测量动物体重确定的动物体重变化百分比的图形表示。a。PDGFR-β同源模型中假定ATP结合囊中垂直结合模式下11（粉红色）的对接姿势。袖珍氨基酸用绿色表示为棒状。口袋中与11形成最强相互作用的氨基酸被描述为绿色圆柱体。b。在PDGFR-β同源模型的假定ATP结合囊中，11（粉红色）以类ATP水平结合模式对接。袖珍氨基酸用绿色表示为棒状。口袋中与11形成最强相互作用的氨基酸被描述为绿色圆柱体。
图8
图8
在MDA-MB-435侧翼异种移植模型中，21次治疗降低了原发性肿瘤生长和肿瘤血管密度。将500000个MDA-MB-435细胞植入NCr无胸腺nu/nu小鼠的侧翼，并在肿瘤植入后2周的MTD开始，每周两次用载体、多西他赛、舒尼替尼和21进行治疗，直到实验结束。数据代表6-8只动物。（A） 肿瘤体积采用椭球体公式计算：体积=0.52（长×宽×深），以植入后天数表示。（B） 实验结束时，用CD31/PECAM-1抗体和Vectastain ABC试剂盒对肿瘤切片进行染色，以检测肿瘤血管密度。通过计数CD31阳性血管来确定血管密度，并以载体治疗动物的血管密度百分比表示。（C） 通过在实验开始和结束时测量动物体重确定的动物体重变化百分比的图形表示。a。PDGFR-β同源模型中假定ATP结合囊中垂直结合模式下11（粉红色）的对接姿势。口袋里的氨基酸用绿色画成棒状。口袋中与11形成最强相互作用的氨基酸被描述为绿色圆柱体。b。在PDGFR-β同源模型的假定ATP结合囊中，11（粉红色）以类ATP水平结合模式对接。袖珍氨基酸用绿色表示为棒状。口袋中与11形成最强相互作用的氨基酸被描述为绿色圆柱体。
图9
图9
构象和1化合物的H NMR10（A）和11（B）化合物21降低了4T1原位乳腺模型的原发肿瘤生长和肺转移。将750个4T1-Lucerase/GFP标记细胞原位植入BALB/c小鼠，并在其MTD时用载体或多西紫杉醇和21进行治疗，多西紫杉醇每周一次，21每周两次，从第7天开始，持续到第32天。每组动物数量=7–10只。（A） 肿瘤体积通过使用游标卡尺测量肿瘤的长度、宽度和深度来确定，并使用椭球体公式：体积=0.52（长×宽×深），每周两次。（B） 在每次治疗前记录动物重量，并将其绘制为重量变化百分比。（C） 32天后，对动物实施安乐死，切除肺部，并立即使用LumaScope荧光成像系统进行25倍成像。每个肺的转移数用手计数并用图形表示。（D） 肺转移区域的三个代表性图像（箭头）。
图9
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构象和1化合物的H NMR10（A）和11（B）化合物21降低了4T1原位乳腺模型的原发肿瘤生长和肺转移。将750个4T1-Lucerase/GFP标记细胞原位植入BALB/c小鼠，并在其MTD时用载体或多西紫杉醇和21进行治疗，多西紫杉醇每周一次，21每周两次，从第7天开始，持续到第32天。每组动物数量=7–10只。（A） 肿瘤体积通过使用游标卡尺测量肿瘤的长度、宽度和深度来确定，并使用椭球体公式：体积=0.52（长×宽×深），每周两次。（B） 在每次治疗前记录动物体重，并以重量变化百分比的形式绘制图表。（C） 32天后，对动物实施安乐死，切除肺部，并立即使用LumaScope荧光成像系统进行25倍成像。每个肺的转移数用手计数并用图形表示。（D） 肺转移灶区域的三张代表性图像（箭头）。
图10
图10
化合物11和21抑制纯化猪脑微管蛋白的聚合。化合物与2.2 mg/mL纯化猪脑微管蛋白在10%甘油和GTP的存在下在10μM培养。CA-4作为阳性对照。
图11
图11
化合物11和21导致细胞微管的丢失。用载体（DMSO）、50 nM CA-4、100 nM 11或1μM 21处理A-10细胞18 h。然后固定细胞并用间接免疫荧光技术显示微管。
方案1
方案1
4-氯-2,6-二甲基呋喃[2,3的合成-d日]嘧啶20。
方案2
方案2
合成N个-芳基-2,6-二甲基呋喃[2,3-d日]嘧啶-4-胺3-15。
方案3
方案3
盐酸盐的合成21。
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