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.2014年6月17日;111(24):8985-90.
doi:10.1073/pnas.1400514111。 Epub 2014年6月2日。

酵母线粒体钙单转运蛋白的重组

附属公司

酵母线粒体钙单转运蛋白的重组

埃里卡·科瓦奇斯·博根等。 美国国家科学院程序. .

摘要

线粒体钙单转运蛋白是一种高度选择性的钙通道,广泛分布于真核生物中,但在酿酒酵母中不存在。人类单转运蛋白全息复合物(uniplex)的分子成分最近已被鉴定。单复合体由三个跨膜亚单位组成,即线粒体钙单转运蛋白(MCU)、其副转运蛋白MCUb和必需的MCU调节蛋白(EMRE),以及两个可溶性调节成分MICU1和副转运蛋白MICU2。体内单转运蛋白活性所需的最低成分尚不清楚。在这里,我们考虑盘状网柄菌(Dictyostelium discoideum,Dd),它是后生动物和真菌的变形虫外群的一员,并表明它具有高度简化的单转运机制。我们发现,盘状芽孢杆菌线粒体表现出与单转运蛋白活性兼容的膜电位依赖性钙摄取,并且DdMCU的表达补充了缺乏MCU或EMRE的人类细胞的线粒体钙摄取缺陷。此外,仅在酵母中表达DdMCU就足以重建线粒体钙单转运蛋白活性。在建立了酵母作为体内重建系统后,我们重建了人类单转运体。我们表明,MCU和EMRE的共同表达足以支持单转运蛋白的活性,而仅表达MCU是不够的。我们的工作建立了酵母作为一个强大的体内重建系统的单运载体。使用该系统,我们确认MCU是孔形成亚单位,定义了后生动物和非偶氮单运输者活动所需的最小遗传元素,并对单运输者机械的进化提供了有价值的见解。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
线粒体钙单转运蛋白D.盘状体. (A类)的分类关系D.盘状体关于酿酒酵母智人,基于NCBI分类树。包括每个物种中单一同源物的数量。(B类)的域组织D.盘状体MCU同源物(DdMCU)与人类MCU(HsMCU)的比较。线粒体靶向序列;线圈,线圈域;TM,跨膜结构域。(C类) (左侧)透性化细胞线粒体钙吸收的典型痕迹D.盘状体不添加药物的阿米巴(Ctrl),在解偶联剂(CCCP)、线粒体呼吸链抑制剂(抗霉素A、鱼藤酮和寡霉素)、Ru360或钌红(RuRed)存在下对45µM CaCl的反应2. (赖特)显示钙相对摄取率的直方图,定义为20-30 s之间线性拟合的斜率,标准化为Ctrl(平均值±SD);n个≥3.
图2。
图2。
DdMCU在人类细胞中对人类单转运蛋白的功能互补。(A类)从表达HsMCU或DdMCU的HEK-293T MCU KO细胞分离的线粒体的碳酸盐提取。P、 颗粒;SN,上清液;Oxa1,线粒体内膜控制;SDHB,线粒体基质控制。(B类)蛋白酶K处理表达HsMCU或DdMCU的MCU KO细胞的有丝分裂体。T、 用1%Triton X-100进行预处理。0'、10'和20'表示与蛋白酶K孵育的持续时间(C类)表达所示蛋白质的洋地黄素渗透MCU KO细胞中钙吸收的典型痕迹,并在所示位置用Ru360处理。直方图显示钙摄取的相对速率,定义为20-30 s之间线性拟合的斜率,归一化为HsMCU(平均值±SD);n个免疫印迹分析显示蛋白质在全细胞裂解物中表达。ATPB:复合Vβ亚单位。(D–F型)重复添加5µM CaCl期间钙吸收的代表性痕迹2(黑色箭头)在没有或存在线粒体抑制剂的情况下表达DdMCU的渗透MCU KO细胞(如图1所示)(D类E类)和表达DdMCU(AIIA)突变体的渗透MCU KO细胞(F类). (G公司)在表达DdMCU或HsMCU的渗透性MCU KO细胞中,钙吸收率与线粒体膜电位(ΔΨ)的关系。使用0-500 nM CCCP改变线粒体膜电位。CaCl后15–20秒的钙吸收率2注射被绘制为初始膜电位的函数(平均值±标准差);n个= 3. (H(H))表达DdMCU或DsRed的HEK-293T EMRE KO细胞的典型钙摄取痕迹和细胞裂解物的Western blot,与C类.
图3。
图3。
酵母线粒体中DdMCU、HsMCU和EMRE的异源表达(A类)使用VDAC作为负载控制,对表达指示蛋白质或空载体控制(Ctrl)的酵母细胞的细胞裂解物和线粒体进行免疫印迹分析。DdMCU中的低分子量带或DdMTS公司表达HsMCU的细胞很可能是蛋白质的降解产物。(B类)从表达所示蛋白质的酵母细胞分离的洋地黄素固体化线粒体的BN-PAGE。左侧显示了标准分子量标记。
图4。
图4。
利用DdMCU(一种单一定义的遗传成分)重建酵母线粒体钙单转运蛋白活性。(A–C)重复20µM CaCl的代表性痕迹2添加(黑色箭头)到从空载体控制(Ctrl)中分离出来的带电线粒体(A类)和来自表达DdMCU(B类)和DdMCU(AIIA)-表达(C类)酵母细胞,使用钙离子载体ETH129作为对照,用钙绿-5N监测线粒体外钙水平。(D–F型)重复添加20µM CaCl期间钙吸收的代表性痕迹2(黑色箭头)至表达DdMCU的酵母线粒体,与1µM呼吸链复合物III抑制剂抗霉素A预孵育(D类)或1µM解偶联剂CCCP(E类),或在不含磷酸盐的缓冲液中(F类).
图5。
图5。
酵母中人线粒体钙单转运蛋白活性的重建。(A–C)重复20µM CaCl的代表性痕迹2添加(黑色箭头)到从表达DdMTS公司HsMCU公司(A类),DdMTS公司HsMCU+EMRE公司(B类)、和DdMTS公司HsMCU(AIMA)+EMRE(C类),使用钙离子载体ETH129作为对照。(D–G型)重复添加20µM氯化钙过程中钙吸收的代表性痕迹2(黑色箭头)至DdMTS公司用2µM Ru360预培养表达HsMCU+EMRE的酵母线粒体(D类),1µM呼吸链复合物III抑制剂抗霉素A(E类),或10µM解偶联剂CCCP(F类)或在不含磷酸盐的缓冲液中(G公司).

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