TET1 is a maintenance DNA demethylase that prevents methylation spreading in differentiated cells

doi:10.1093/nar/gku372

.2014年6月；42（11）：6956-71。

doi:10.1093/nar/gku372。 Epub 2014年5月29日。

TET1是一种维持DNA去甲基化酶，可防止甲基化在分化细胞中扩散

金春雷¹, 岳麓², 雅罗斯拉夫·杰利内克^三, 梁寿丹⁴, 马科斯·R·H·埃斯特西奥⁵, 米歇尔·克雷格·巴顿⁶, Jean-Pierre J Issa女士⁷

附属机构

¹德克萨斯州休斯顿市德克萨斯大学生物医学研究生院，德克萨斯州休斯敦市德克萨斯大学健康科学中心，邮编77030，美国白血病系，德克萨斯大学安德森癌症中心，德克萨斯州77030休斯顿，美国生物化学和分子生物学系，德克萨斯州立大学安德森肿瘤中心，邮编：77030，美国费尔斯癌症研究和分子生物学研究所，天普大学，费城，宾夕法尼亚州19140，美国。
²德克萨斯大学安德森癌症中心白血病系，德克萨斯州休斯顿，邮编77030，美国德克萨斯州休斯敦，德克萨斯大学安德逊癌症中心，分子致癌系，邮编770030。
^三德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心白血病系，德克萨斯州休斯顿，邮编77030，美国宾夕法尼亚州费城坦普尔大学费尔斯癌症研究和分子生物学研究所，邮编19140。
⁴德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心生物信息学和计算生物学系，美国德克萨斯州休斯顿，邮编77030。
⁵德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心白血病系，德克萨斯州休斯顿，邮编77030，美国生物化学和分子生物学系，德克萨斯大学医学硕士安德森癌症研究中心，德克萨斯州，邮编770030，美国分子致癌系，德克萨斯州立大学医学博士Anderson癌症中心，美国德克萨斯州休斯敦，邮编770.30。
⁶德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心生物化学和分子生物学系，美国德克萨斯州休斯顿，邮编77030。
⁷德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心白血病系，德克萨斯州休斯顿，邮编77030，美国宾夕法尼亚州费城坦普尔大学费尔斯癌症研究和分子生物学研究所，邮编19140jpissa@temple.edu。

PMID： 24875481
预防性维修识别码：项目经理4066785
内政部： 10.1093/nar/gku372号

TET1是一种维持DNA去甲基化酶，可防止甲基化在分化细胞中扩散

金春雷等。核酸研究. 2014年6月.

.2014年6月；42(11):6956-71.

doi:10.1093/nar/gku372。 Epub 2014年5月29日。

作者

金春蕾¹, 岳麓², 雅罗斯拉夫·耶利内克^三, 梁寿丹⁴, 马科斯·R·H·埃斯特西奥⁵, 米歇尔·克雷格·巴顿⁶, Jean-Pierre J Issa女士⁷

附属机构

¹德克萨斯州休斯顿市德克萨斯大学生物医学研究生院，德克萨斯州休斯敦市德克萨斯大学健康科学中心，邮编77030，美国白血病系，德克萨斯大学安德森癌症中心，德克萨斯州77030休斯顿，美国生物化学和分子生物学系，德克萨斯州立大学安德森肿瘤中心，邮编：77030，美国费尔斯癌症研究和分子生物学研究所，天普大学，费城，宾夕法尼亚州19140，美国。
²德克萨斯大学安德森癌症中心白血病系，德克萨斯州休斯顿，邮编77030，美国德克萨斯州休斯敦，德克萨斯大学安德逊癌症中心，分子致癌系，邮编770030。
^三德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心白血病系，德克萨斯州休斯顿，邮编77030，美国宾夕法尼亚州费城坦普尔大学费尔斯癌症研究和分子生物学研究所，邮编19140。
⁴美国德克萨斯州休斯顿市得克萨斯大学安德森癌症中心生物信息学和计算生物学系，邮编77030。
⁵德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心白血病系，德克萨斯州休斯顿，邮编77030，美国生物化学和分子生物学系，德克萨斯大学医学硕士安德森癌症研究中心，德克萨斯州，邮编770030，美国分子致癌系，德克萨斯州立大学医学博士Anderson癌症中心，美国德克萨斯州休斯敦，邮编770.30。
⁶得克萨斯大学安德森癌症中心生物化学和分子生物学系，美国得克萨斯州休斯敦，邮编77030。
⁷德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心白血病系，德克萨斯州休斯顿，邮编77030，美国宾夕法尼亚州费城坦普尔大学费尔斯癌症研究和分子生物学研究所，邮编19140jpissa@temple.edu。

PMID： 24875481
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内政部： 10.1093/nar/gku372号

摘要

TET1是一种5-甲基胞嘧啶加氧酶，其DNA去甲基化活性与多能性和重编程有关。然而，TET1在发育重编程以外的DNA甲基化调控中的确切作用尚不清楚。这里，我们表明TET1催化结构域的过度表达而非全长TET1（TET1-FL）诱导分化细胞中大规模的全局DNA去甲基化。全基因组定位显示，随着DNA甲基化程度的增加，TET1-FL产生的5-羟甲基胞嘧啶受到抑制，这可以通过TET1-FL通过其CXXC结构域优先结合非甲基化CpG岛（CGI）来解释。TET1-FL在低甲基化CGI的边缘特异性积累5-羟甲基胞嘧啶，而内源性TET1的敲除诱导甲基化从甲基化边缘扩散到低甲基化的CGI。我们还发现，TET1-FL过度表达后的基因表达变化相对较小，且与其加氧酶功能无关。因此，我们的结果确定TET1是一种维持性DNA去甲基化酶，它不是故意降低甲基化水平，而是专门防止异常甲基化扩散到分化细胞中的CGI中。

©作者2014。由牛津大学出版社代表核酸研究出版。

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数字

**图1。**
5hmC的产生和TET1过表达诱导的DNA去甲基化。(A类)用抗TET1抗体对HEK293T细胞中TET1-FL过度表达的Western blot分析。转染后3天用FACS收集细胞。(B类)利用抗FLAG抗体对HEK293T细胞中TET1-FL、TET1-CD及其催化突变对照的过度表达进行Western blot分析。转染后3天通过FACS收集细胞。(C类)过表达（m）TET1-FL或（m）TEM1-CD的HEK293T细胞基因组5hmC水平的DNA斑点杂交分析。细胞在转染后的指定时间点通过FACS收集。(D类)转染后3天或7天FACS收集的过度表达（m）TET1-CD或（m）TEM1-FL的HEK293T细胞中四个甲基化内源性基因组位点的亚硫酸氢盐焦磷酸序列分析。数据表示平均值±SD(n个=3）**P（P）*< 0.05, ***P（P）*<0.01（按学生）t吨-与mTET1-CD-过表达细胞进行比较。(E类)*HpaII公司*-转染后3天或7天FACS收集的过度表达（m）TET1-CD或（m）TEM1-FL的HEK293T细胞中其他四个内源性基因组位点的基于PCR的DNA甲基化检测。低甲基化*UBE2B型*基因被用作完全消化*HpaII公司*.数据表示平均值±SD(n个= 2). **P（P）*< 0.05, ***P（P）*<0.01（按学生）t吨-与mTET1-CD-过表达细胞进行比较。

**图2。**
TET1-CD而非TET1-FL的过度表达诱导DNA整体去甲基化。（A、C–E、G和H）显示了过度表达TET1-CD的HEK293T细胞与mTET1-CD的甲基化%的比较(A类,C类和D类)和TET1-FL与mTET1-FL(E类,克和**H（H）**)DREAM对数千个CpG位点进行了定量分析（每个图中显示的确切位点数量）。（A）)和（E）绘制所有检测到的位置(C类)CGI中的（G）地块，（D）和（H）地块非CGI地块。在（A）中，蓝色圆点和数字代表去甲基化≥20%的CpG位点。CGI注释来自UCSC网站。过度表达TET1-CD的HEK293T细胞DNA去甲基化程度与基础甲基化水平的关系（B和F）箱线图(B类)或TET1-FL(F类). 基础甲基化水平（相应突变对照细胞中的甲基化百分比）按0%至100%甲基化的10%间隔分组。方框表示四分位范围，胡须表示2.5%和97.5%。转染后3天或7天通过FACS收集过度表达（m）TET1-CD或（m）TEM1-FL的细胞。

**图3。**
TET1-FL在低甲基化CGI边缘诱导5hmC的特异性积累。(A类)HEK293T细胞中过度表达（m）TET1-CD或（m）TEM1-FL的hMeDIP-Seq谱的示例。基因分布（外显子）和CGI如下图所示。(B类)在过度表达（m）TET1-CD或（m）TEM1-FL的HEK293T细胞中检测到的5hmC峰的基因组分布。上游：相对于TSS为−5至−1 kb；启动子：相对于TSS为−1至0.5 kb；下游：相对于TES−0.5至1 kb；基因间：从TES到下游基因的-1kb。(C类)5hmC标签在过度表达（m）TET1-CD或（m）TEM1-FL的HEK293T细胞中的基因体分布。每个基因体均归一化为0–100%。（D和E）重叠CGI的TSS周围5hmC标签的分布(D类)或非CGI(E类). (F类)5hmC标签在位于基因启动子的CGI中的分布。在27 639个CGI中，总共有13 913个CGI位于人类基因组的启动子中。（G和H）5hmC标记在低甲基化（甲基化<10%，克)或高甲基化（甲基化>50%，**H（H）**)基于DREAM数据。DREAM结果涵盖了739个低甲基化和1059个高甲基化非促性腺激素CGI，并分析了5hmC分布。转染后3天或7天通过FACS收集过度表达（m）TET1-CD或（m）TEM1-FL的细胞。将（F–H）中的每个CGI归一化为0–100%。（C）–（H）的键位于底部。

**图4。**
TET1-FL通过其CXXC结构域优先与非甲基化CGI结合，导致其5hmC产量有限，无法诱导显著的DNA去甲基化。(A类)标准化5hmC标记密度作为基础DNA甲基化水平的函数。基础甲基化水平（相应突变对照细胞中的甲基化百分比）按0%至100%甲基化的10%间隔分组。（B和C）在过度表达（m）TET1-CD的HEK293T细胞中跨基因体绘制的标准化5hmC标记密度（左轴）和DNA甲基化水平（右轴）(B类)或（m）TET1-FL(C类). 实线表示5hmC标记密度和虚线DNA甲基化。(D类)不同甲基化CGI中TET1-CD和TET1-FL占用率的FLAG-ChIP-qPCR分析。数据表示平均值±SD(n个= 3). 转染后3天用FACS收集细胞。(E类)差异甲基化CGI中TET1-FL和CXXC结构域突变TET1-FL-C594A占用率的FLAG ChIP-qPCR分析。数据表示平均值±SD(n个= 3). 转染后3天用FACS收集细胞。图中还显示了TET1-FL和TET1-FL-C594A过度表达的Western blot分析。

**图5。**
TET1-FL过度表达后稀疏甲基化CGI中DNA甲基化降低。（A–D）所示为基础DNA甲基化水平为1–5%的CGI CpG位点过度表达TET1-FL的HEK293T细胞与mTET1-FL甲基化百分比的比较(A类), 5–10% (B类), 10–15% (C类)或15-20%(D类). 转染7天后用FACS收集细胞。通过DREAM定量测量DNA甲基化，仅包括已测序≥100个标记的CpG位点，以确保准确性（每个图中显示的确切位点数量）。*P（P）*从Wilcoxon配对有符号秩检验中获得值。

**图6。**
*技术工程师1*敲除导致DNA甲基化在甲基化CGI边缘扩散。(A类)shRNA介导的蛋白质印迹分析*技术工程师1*敲除转染不同TET1 shRNA的两个独立HEK293T克隆(B类)DNA斑点杂交显示*技术工程师1*击倒。(C类)ChIP-qPCR显示未甲基化CGI的TET1占用率在*技术工程师1*击倒。数据表示平均值±SD(n个=3）**P（P）*< 0.05, ***P（P）*<0.01（按学生）t吨-与shControl克隆细胞进行比较。(D类)亚硫酸氢钠序列分析显示*技术工程师1*击倒。顶部面板包含以下图表*PACS1项目*,*哈萨克斯坦*,*MUM1型*,*RFX6型*和*VAX2型*CGI促进剂。绿色横条表示CGI。红色条表示通过亚硫酸氢盐测序研究的边界放大器的位置。在下面的面板中，每行代表一个不同的克隆序列，黑色方块代表甲基化的CpG位点。平均甲基化在每个面板下方显示为平均值±SD(n个= 3). 在所有情况下，边界甲基化在*技术工程师1*击倒。

**图7。**
TET1独立于其去甲基化活性调节基因转录。（A和B）的影响*技术工程师1*敲除其靶基因的表达(A类)或不带(B类)增加DNA甲基化扩散到CGI促进。数据表示平均值±SD(n个=3）**P（P）*< 0.05, ***P（P）*<0.01（按学生）t吨-与shControl单元进行比较。(C类)RNA序列转录景观*技术工程师1*载体控制基因和（m）TET1-FL-或（m）TEM1-CD-过度表达HEK293T细胞。mTET1-FL和mTET1-CD中引入的两个替换突变也通过RNA-seq验证。（D和E）比较载体对照、TET1-FL和mTET1-FL过度表达之间RNA-seq衍生的基因表达谱的散点图(D类)在载体控制中，TET1-CD和mTET1-CD过度表达(E类). 皮尔逊相关系数，第页，列在每个图表中。(F类)维恩图显示TET1-FL、mTET1-FL、TET1-CD和mTET1-CD过度表达的差异表达基因重叠（>2倍变化，FDR<0.05）。(克)热图显示TET1-FL、mTET1-FL、TET1-CD和mTET1-CD过度表达的差异表达基因的层次聚类。转染后第3天用FACS收集所有细胞。

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