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.2014年6月26日;510(7506):547-51.
doi:10.1038/nature13267。 Epub 2014年5月25日。

细胞周期蛋白D1-Cdk4独立于细胞周期进程控制葡萄糖代谢

附属公司

细胞周期蛋白D1-Cdk4独立于细胞周期进程控制葡萄糖代谢

李永进(Yoonjin Lee)等。 性质. .

摘要

胰岛素构成维持葡萄糖稳态的主要进化保守激素轴;这个轴的失调会导致糖尿病。PGC-1α(过氧化物酶体增殖因子激活受体-γ辅活化因子-1α)将胰岛素信号与葡萄糖和脂质代谢基因的表达联系起来。组蛋白乙酰转移酶GCN5(一般对照非抑制蛋白5)乙酰化PGC-1α并抑制其转录活性,而sirtuin 1脱乙酰化并激活PGC-1α。虽然胰岛素是增殖细胞中的有丝分裂信号,但细胞周期机制的组成部分是否有助于其代谢作用尚不清楚。在这里,我们报告了在小鼠中,胰岛素激活细胞周期蛋白D1-细胞周期蛋白依赖性激酶4(Cdk4),从而增加GCN5乙酰转移酶活性,并独立于细胞周期进展抑制肝葡萄糖生成。通过基于细胞的高通量化学筛选,我们发现了一种Cdk4抑制剂,它能有效降低PGC-1α乙酰化。胰岛素/GSK-3β(糖原合成酶激酶3-β)信号通过在细胞核中隔离细胞周期蛋白D1诱导细胞周期蛋白D蛋白稳定性。同时,饮食氨基酸增加肝脏细胞周期蛋白D1信使RNA转录物。激活的细胞周期蛋白D1-Cdk4激酶磷酸化并激活GCN5,GCN5随后乙酰化并抑制糖异生基因上的PGC-1α活性。肝细胞周期蛋白D1的缺失导致糖异生增加和高血糖。在糖尿病模型中,细胞周期蛋白D1-Cdk4长期升高,对禁食/进食过渡不敏感;然而,这种激酶的进一步激活使血糖正常化。我们的研究结果表明,胰岛素利用有丝分裂后细胞中细胞周期机制的组成部分独立于细胞分裂来控制葡萄糖稳态。

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图1
图1
细胞周期蛋白D1-CDK4通过GCN5调节PGC-1α乙酰化。a)化学品的散点图,在X轴上绘制第一个测试z分数,在Y轴上绘制重复测试分数。b)Fascaplysin减少PGC-1α乙酰化和Rb磷酸化。c)Fascaplysin和PD 0332991治疗降低PGC-1α乙酰化。d)CDK4敲除导致PGC-1α脱乙酰化。e)GCN5敲除减弱fascaplysin介导的PGC-1α脱乙酰化。f)GCN5乙酰转移酶活性在fascaplysin治疗后降低(n=2,平均值±S.E.M)。g)内源性GCN5和CDK4相互作用。h)细胞周期蛋白D1-CDK4激酶磷酸化GCN5体外试验。i)与GCN5野生型(WT)相比,细胞周期蛋白D1-CDK4激酶对GCN5 T272A/S372A(AA)的磷酸化作用减弱。j)GCN5 T272A/S372A显示乙酰转移酶能力下降。k)GCN5 T272A/S372A降低了乙酰转移酶活性,并且对fascaplysin治疗不敏感。动力学常数由迈克利斯·曼顿方程计算(n=4,AU/min=任意单位/min,平均值±S.E.M)。这些实验使用了U-2OS细胞。
图2
图2
细胞周期蛋白D1-CDK4调节原代肝细胞和整个动物的糖异生。a-b公司)PD 0332991增加糖异生基因表达和葡萄糖生成(:采用Tukey后验的单向方差分析,n=3,b条:双尾非配对t检验,n=8)。c)PD0332991治疗可降低PGC-1α乙酰化。d-e)CDK4敲除增加糖异生基因表达和葡萄糖生成(d日:Tukey后验的单向方差分析,n=6,e(电子):双尾非配对t检验,n=6)。f)CDK4缺失后PGC-1α乙酰化减少。g-h)细胞周期蛋白D1野生型降低糖异生基因的表达,细胞周期蛋白D2野生型和细胞周期蛋白T1 T286A,但不影响细胞周期蛋白D_1 K112E抑制葡萄糖生成(:采用Tukey后验的单向方差分析,n=3/GFP,PGC-1α,n=6/细胞周期蛋白D1 WT和KE,小时:采用Dunnett后验进行单因素方差分析,n=8)。i)细胞周期蛋白D1野生型(WT)和T286A(TA)的过表达,而不是细胞周期蛋白D1 K112E(KE)的过表达,诱导PGC-1α乙酰化。j)GCN5敲除通过CDK4敲除减弱葡萄糖生成的增加(双尾非配对t检验,n=8)。k)PD 0332991增加GCN5野生型(WT)的葡萄糖生成,但GCN5 T272A/S372A(AA)没有增加(Newman-Keuls后测的单向方差分析,n=8)。1米)PD 0332991用药增加第1包小鼠的基因表达和血糖(双尾非配对t检验,n=18/vehicle,n=17/PD 0332991)。n-o)肝中细胞周期蛋白D1 T286A过度表达可降低糖原生成基因表达和血糖(双尾非配对t检验,n=10/GFP,n=9/D1 T286A)。第页)通过丙酮酸盐耐受性试验(双尾非配对t检验,n=20/GFP,n=24/D1 T286A AUC=曲线下面积)评估,肝细胞周期蛋白D1 T286 A过度表达降低了肝葡萄糖生成能力。统计显著性用星号表示,对应于*P(P)<0.05, **P(P)<0.01, ***P(P)<0.001. 数据显示为平均值±S。E.M.公司。
图3
图3
细胞周期蛋白D1-CDK4受胰岛素/GSK3β调节,肝细胞周期蛋白D_1缺失导致再喂养时糖异生增加和血糖升高。a)细胞周期蛋白D1基因表达在再喂养期间增加(Tukey事后测试的单向方差分析,n=3/fast和10小时refed,n=4/4小时refed)。b)细胞周期蛋白D1蛋白和Rb磷酸化在再喂养时被诱导(N=细胞核和C=细胞质肝提取物)。c)GCN5的磷酸化作用在重新进料时增加。使用GFP或GCN5腺病毒感染的肝脏中的抗磷酸S*P(pS*P)抗体免疫沉淀GCN5。d)禁食和再喂养后肝细胞倍性没有改变(n=5)。e)肝脏Ki-67染色在禁食和再喂养时无差异。小肠作为阳性对照。f)胰岛素和GSK3β抑制剂治疗后,原代肝细胞中的核细胞周期蛋白D1蛋白水平升高。所有细胞均感染细胞周期蛋白D1野生型腺病毒。g)胰岛素和GSK3β抑制剂抑制糖异生基因表达。所有细胞均感染PGC-1α腺病毒(Tukey后试验单向方差分析,n=6)。h)GCN5的磷酸化由胰岛素诱导,并通过PD0332991处理钝化。GCN5过度表达,而GFP用作阴性对照。i)细胞周期蛋白D1是由饮食中摄入的氨基酸转录诱导的。小鼠隔夜禁食或用食物、空热量、葡萄糖或葡萄糖和氨基酸饮食喂养4小时(Tukey后试验的单向方差分析,n=5)。j-k)肝特异性细胞周期蛋白D1 KO(D1 LKO)小鼠在禁食期间的糖异生基因表达和血糖水平没有差异。l-m)D1 LKO小鼠在重新喂食4小时后表现出糖异生基因表达增加和血糖升高(Tukey后验的单向方差分析,结合4组n=3/禁食,n=5/重新喂食)。n)D1 LKO小鼠表现出轻度葡萄糖不耐受(双向方差分析,多重比较,n=11/WT1,n=7/WT2,n=10/D1 LKO)。o)D1 LKO小鼠表现出轻度胰岛素不耐受(双向方差分析,显著交互作用,多重比较,n=10/WT1,n=7/WT2,n=9/D1 LKO)。统计显著性用星号表示,对应于*P(P)<0.05, **P(P)<0.01, ***P(P)<0.001. 数据显示为平均值±S。E.M.公司。
图4
图4
在糖尿病高胰岛素小鼠中,细胞周期蛋白D1-CDK4失调,并且细胞周期蛋白D2-CDK4过度激活可减弱糖尿病表型。a)细胞周期蛋白D1在分贝/分贝小鼠(N=细胞核和C=细胞质肝提取物)。b-c)细胞周期蛋白D1 T286A,而不是细胞周期蛋白D 1 K112E在肝脏的过度表达抑制了糖异生基因和血糖分贝/分贝小鼠(单向方差分析,Tukey后测,n=6/GFP,D1 K112E,n=5/D1 T286A)。d-h)分贝/分贝小鼠,cyclin D1 T286A在肝脏过度表达可抑制高胰岛素-血糖钳夹检测的肝葡萄糖生成。d)血浆血糖和葡萄糖输注率(双向方差分析,显著交互作用,n=7)。e)体重。f)固定葡萄糖输注速率。g)全身葡萄糖摄取。h)肝葡萄糖输出量(f-g(胎龄),的双尾非配对t检验d小时,n=7)。统计显著性用星号表示,对应于*P(P)<0.05, **P(P)<0.01, ***P(P)<0.001. 数据显示为平均值±S。E.M.公司。
扩展数据图1
扩展数据图1
基于细胞的高通量筛选揭示了调节PGC-1α乙酰化的化合物。a)高通量化学分析方案。b)列出了z值显著大于3.0或小于-3.0的化合物。抑制剂表示增加PGC-1α乙酰化的化合物,而活化剂表示减少PGC-1β乙酰化的物质。
扩展数据图2
扩展数据图2
细胞周期蛋白D1-CDK4通过GCN5调节PGC-1α乙酰化。a)Fascaplysin以剂量依赖的方式降低PGC-1α乙酰化。用31.25nM至8μM的fascaplysin浓度处理PGC-1α乙酰化的剂量依赖性反应。集成电路50值是使用以下所述分析中的三个独立测量值计算得出的扩展数据图1 a.b)fascaplysin和PD 0332991的化学结构。c)CDK4被用于图1d。d)在EX527或曲霉菌素A处理后,Fascaplysin降低PGC-1α乙酰化。在收获前,如果是1μM fascaplysin,则将细胞处理8小时;如果是1µM EX527或曲古菌素A,则处理4小时。DMSO(-)作为对照治疗。e)Fascpalysin对PCAF介导的PGC-1α乙酰化有钝化作用。f)外源表达的CDK4和GCN5相互作用。作为对比,使用PGC-1α、Sirt1和Sirt6,而GFP作为阴性对照过度表达。g)细胞周期蛋白D1-CDK4复合物对GCN5的磷酸化作用被fascaplysin降低。将二甲基亚砜或1μM fascaplysin添加到激酶反应中。h)体外细胞周期蛋白D1-CDK4对GST-GCN5重组蛋白(1-224aa、1-386aa、1-1553aa、1-837aa)的磷酸化以及这些片段的蛋白水平。i)GCN5野生型(WT),用抗磷酸化S*P(pS*P)抗体免疫沉淀的fascaplysin和GCN5 T272A/S372A(AA)突变体处理。j)PGC-1α的乙酰化与结合到GCN5的PAF65β的量密切相关。使用过表达不同数量GCN5的U-2OS核提取物进行western blot分析,以检测GCN5和PAF65β。将空载体转染为阴性对照。k)与GCN5野生型(WT)相比,GCN5 T272A/S372A(AA)和PAF65β之间的相互作用减少。U-2OS细胞用于western blot分析实验。
扩展数据图3
扩展数据图3
细胞周期蛋白D1-CDK4调节原代肝细胞和整个动物的糖异生。a)内源性、福斯克林诱导(Fsk)或腺病毒过度表达(O/E)PGC-1α的Western blot分析。原代肝细胞核提取物用于免疫沉淀PGC-1α。在收获前48小时用GFP或PGC-1α感染细胞。收获前添加10μM forskolin 2小时。b)PD 0332991增加forskolin诱导的糖异生基因表达。在饥饿培养基孵育3小时后,用10μM forskolin处理原代肝细胞1.5小时,同时添加1μM PD 0332991过夜(Tukey后试验的单向方差分析,n=3)。c)CDK4敲除增加forskolin诱导的糖异生基因表达(Tukey后测单向方差分析,n=3)。d)细胞周期蛋白D1野生型,而非细胞周期蛋白D2 K112E突变,抑制forskolin诱导的糖异生基因表达(Tukey后测单向方差分析,n=3)。e)细胞周期蛋白D1-CDK4对GCN5、FoxO1 N末端、FoxO3 C末端、FoxO3A和PGC-1αSR结构域的磷酸化作用。f)在HepG2细胞中,PGC-1α敲低通过fascaplysin阻断毛喉素诱导的糖异生基因的增加。用30μM forskolin和1μM fascaplysin隔夜处理PGC-1α敲除或阴性对照HepG2细胞(Tukey后试验的单向方差分析,n=3)。g)GCN5基因敲除可减缓CDK4基因敲除引起的糖异生基因表达增加。qRT-PCR分析第1包Gcn5公司以及CDK4和GCN5击倒的西区。所有细胞均感染了PGC-1α腺病毒(Tukey后试验单向方差分析,n=15)。h)PD 0332991在与GCN5野生型(WT)过度表达结合时增加糖异生基因,但与GCN5T272A/S372A(AA)突变体结合时不增加。GFP感染的细胞显示为与过表达GCN5的细胞的比较。所有细胞均感染了PGC-1α腺病毒(双尾非配对t检验,n=6)。I-j)使用溶媒或150mg/kg PD 0332991治疗的小鼠的核(N)和细胞质(C)肝提取物,通过Rb和AKT的血清和western blot分析测得的胰岛素水平,如图2lm(:双尾非配对t检验,n=18/GFP,n=17/PD 0332991)。k)GFP或cyclin D1 T286A尾静脉注射小鼠的细胞周期蛋白D1和Rb磷酸化水平,如图2n-o。统计显著性用星号表示,对应于*P(P)<0.05, **P(P)<0.01, ***P(P)<0.001. 数据显示为平均值±S。E.M.公司。
扩展数据图4
扩展数据图4
与各自的对照治疗相比,PD 0332991给药或cyclin D1 T286A腺病毒过度表达不会引起毒性。a)给药载体或PD 0332991的小鼠的基本生理指标(n=5)。b)注射GFP或cyclin D1 T286A腺病毒小鼠的基本生理指标(n=5)。(ALT=丙氨酸转氨酶,AST=天冬氨酸转氨酶;LDH=乳酸脱氢酶,平均值±S.E.M)
扩展数据图5
扩展数据图5
细胞周期蛋白D1-CDK4受胰岛素/GSK3β调节,肝脏特异性细胞周期蛋白D_1缺失导致再喂养时糖异生和血糖升高。a)细胞周期蛋白D1转录物在再喂养时增加。qRT-PCR分析抄送1,抄送2抄送1通宵禁食、4小时和10小时再喂养BALB/c小鼠肝脏后的基因表达(Tukey后测的单向方差分析,n=3)。b)再喂养时细胞周期蛋白D1蛋白增加。从BALB/C小鼠的核(N)和细胞质(C)肝提取物中测量的禁食和再喂养时cyclin D1蛋白水平和相关信号通路的Western blot分析。c)重复喂养4小时后,细胞周期蛋白D1-CDK4激酶活性增加。体外32通过免疫沉淀细胞周期蛋白D1-CDK4激酶将P从隔夜禁食和4小时参考肝脏的全细胞提取物中并入重组Rb。d)禁食和再喂养时细胞周期蛋白D1蛋白水平及相关信号通路的Western blot分析和qRT-PCR分析抄送1Pgc1α不同组织中的mRNA水平(L=肝脏,M=骨骼肌,B=棕色脂肪组织,W=附睾白色脂肪组织,P=胰腺,双尾非配对t检验,n=12/L,n=4/M,B,W,P)。e)载体或PD 0332991治疗后肝脏和附睾白色脂肪组织(eWAT)中PGC-1α靶基因的qRT-PCR分析(双尾非配对t检验,n=10)。f)Ccnb1号机组太平洋航空公司禁食和再喂养后,肝脏中的基因表达没有变化(n=3/fast和10hrrefed,n=4/4hrrefed)。g)BrdU在肝脏中的掺入在禁食和再喂养时没有变化。小肠作为阳性对照。h)服用药物或PD 0332991后,禁食和重新喂食时,肝脏中的Ki-67染色没有变化。小肠用作阳性对照。i)GFP或cyclin D1 T286A尾静脉注射后禁食和再喂养时,肝脏Ki-67染色无变化。小肠用作阳性对照。j)GFP或cyclin D1 T286A腺病毒尾静脉注射小鼠的肝脏倍体分布无显著差异。通过碘化丙啶染色和流式细胞术测量从肝脏分离的原代肝细胞的倍性分析(n=6/fast和4hr refed,n=4/10hr refed)。k)胰岛素或GSK3β抑制剂治疗原代肝细胞后内源性细胞核(N)和细胞质(C)细胞周期蛋白D1蛋白水平的Western blot分析。l)胰岛素或GSK3β抑制剂治疗原代肝细胞后,PGC-1α乙酰化增加。米)胰岛素或GSK3β抑制剂对细胞周期蛋白D1 mRNA水平无影响(n=3)。n)添加最低必需培养基(MEM)氨基酸可增加原代肝细胞中的cyclin D1 mRNA(Tukey后测试的单向方差分析,n=3)。o)胰岛素不变抄送1原代肝细胞中的mRNA(Tukey后测单向方差分析,n=3)。p-q)体重、肝脏重量和抄送1抄送2野生型和肝脏特异性细胞周期蛋白D1 KO(D1 LKO)小鼠的基因表达(n=3/禁食,n=5/再喂养的4组组合)。r)通过使用野生型和D1 LKO小鼠在禁食(F)和4小时再喂养(R)时的细胞核和细胞质肝提取物,对细胞周期蛋白D1蛋白水平和相关信号通路进行Western blot分析。s)与野生型小鼠相比,D1 LKO小鼠肝脏中PGC-1α的内源性乙酰化减少。肝细胞核提取物中PGC-1α免疫沉淀乙酰化的Western blot分析。重新喂食4小时后处死所有小鼠。t-u)PD 0332991仅在野生型小鼠中增加血糖,但在D1 LKO小鼠中无糖异生基因表达的类似趋势(双尾非配对t检验,n=8,除载体治疗野生型小鼠的n=6外)。v-w)从D1 LKO小鼠分离的原代肝细胞中葡萄糖新生基因表达和肝葡萄糖生成增加(v(v):单向方差分析Tukey后验,n=3,w个:双尾非配对检验,n=6)。统计显著性用星号表示,对应于*P(P)<0.05, **P(P)<0.01, ***P(P)<0.001. 数据显示为平均值±S。E.M.公司。
扩展数据图6
扩展数据图6
在糖尿病高胰岛素小鼠中,细胞周期蛋白D1-CDK4失调,并且细胞周期蛋白D2-CDK4过度激活可减弱糖尿病表型。a)糖异生和抄送1禁食和再喂养后基因表达的变化勒普数据库/+(数据库/+)和勒普分贝/分贝(分贝/分贝)小鼠肝脏(双尾非配对t检验,n=3)。b)与对照饮食喂养的小鼠相比,高脂肪饮食喂养的老鼠在禁食和再喂养后肝脏中的细胞周期蛋白D1蛋白长期升高。使用细胞核(N)和细胞质(C)肝脏提取物。c-d)禁食后GCN5的磷酸化升高分贝/分贝或高脂肪饮食喂养(HFD)小鼠的肝脏与其相应的对照小鼠相比,其对快速参考转换仍不敏感。用鼠尾静脉注射表达GFP或GCN5的腺病毒后的肝脏提取物,对抗磷酸化S*P(pS*P)抗体诱导的GCN5免疫沉淀进行Western blot分析(F=16小时快速,R=4小时参考)。e)肝细胞周期蛋白D1和Rb磷酸化水平分贝/分贝小鼠尾静脉注射GFP、cyclin D1 T286A或cyclin D2 K112E腺病毒,如图所示图4b-c使用了细胞核和细胞质肝提取物。f-g)Cyclin D1 T286A过度表达可降低高脂饮食喂养小鼠的糖异生基因和血糖(双尾非配对t检验,n=6/GFP,n=7/D1 T286 A)。h)尾静脉注射表达GFP或细胞周期蛋白D1 T286A的腺病毒的高脂饮食喂养小鼠肝脏中的细胞周期蛋白D1和Rb磷酸化水平,如扩展数据图4f-g.i)整体模型。统计显著性用星号表示,对应于*P(P)<0.05, **P(P)<0.01, ***P(P)<0.001. 数据显示为平均值±S。E.M.公司。

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