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.2014年10月；21(10):1560-74.
doi:10.1038/cdd.2014.66。 Epub 2014年5月16日。

线粒体代谢指导P19胚胎癌干细胞的干细胞生成和分化

I吠陀-纳德罗 1, R卢雷罗 1, K A梅斯基塔 2, I A巴博萨 1, L C塔瓦雷斯 2, A F布兰科 1, J R埃里克森 三, J神圣 4, E L珀金斯 5, R A卡瓦略 2, P J奥利维拉 6
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线粒体代谢指导P19胚胎癌干细胞的干细胞生成和分化

I吠陀-纳德罗等。 细胞死亡不同. 2014年10月.

摘要

线粒体代谢与干细胞（SCs）中细胞活力和分化之间的关系尚不清楚。在本研究中，我们比较了P19SC分化前后的线粒体生理和代谢，并提出了线粒体活性、细胞分化和干细胞之间联系的独特指纹。与分化的对应物相比，P19SCs的多能性与强大的糖酵解谱和线粒体生物发生和复杂性的降低有关：圆形、低极化和无活性的线粒体具有封闭的通透性过渡孔。线粒体容量的减少增加了它们对二氯乙酸的抵抗力。因此，通过在含谷氨酰胺/丙酮酸的培养基中生长P19SC来刺激线粒体功能，降低了其糖酵解表型，导致多能性电位丧失，分化受损，并使P19SC对二氯乙酸敏感。由于这类SCs在畸胎瘤发展中的核心作用，我们的研究结果强调了线粒体代谢在干细胞、增殖、分化和化疗抵抗中的重要性。此外，目前的研究表明，线粒体代谢的调节是干细胞治疗中诱导细胞分化的一种工具。

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图1
图1
维甲酸诱导P19SC的细胞分化和线粒体形态改变。(一)P19SC和P19dC的相位对比图。P19细胞的免疫染色证实TROMA-1仅在P19dCs中表达。比例尺=10 μ米(b条)多能性（OCT4、NANOG和SOX2）和分化（TROMA-1、武藏和βP19SC和P19dCs中的III-管蛋白）标记。条形图显示了光密度（外径）±S的平均值。D.表示为来自至少三个单独免疫印迹的P19SCs百分比*P（P）<0.05; **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001。(c（c）)P19细胞的电子显微镜照片显示圆形线粒体，其在P19SC和P19dCs（箭头）中的数量几乎相等。图片显示了拍摄的50多个细胞的代表性区域。(d日)使用MitoTracker Red（MTR）或TMRM进行线粒体标记和DAPI或Hoechst进行核标记获得的共聚焦图像显示，P19SCs和P19dCs之间的线粒体形态发生了变化，在单层和球形（3D）中生长。一些球体用钙黄绿素AM染色以测定细胞活力。比例尺=15 μm.条形图显示了使用图像J在单层生长的P19SC和P19dCs荧光图像中测量的线粒体互连性和线粒体伸长，并用MitoTracker染色。数据显示平均值±S。D***P（P）<0.001；n个=15个细胞，三个单独的实验
图2
图2
在用RA处理的P19细胞中，线粒体分化伴随着细胞分化。(一)线粒体生物生成相关蛋白（PGC-1和mTFA）的水平证实了P19SC向P19dCs过渡期间线粒体的分化。TOM20和COX IV含量表明线粒体含量相似。条形图显示了光密度（外径）±S的平均值。D.表示为来自至少三个单独免疫印迹的P19SCs百分比*P（P）<0.05**P（P）<0.01. (b条)线粒体（m）和细胞溶质（c）提取物中mTFA的定位证实了其成熟形式（25 线粒体提取物中的kDa）。TOM20用于检查线粒体部分的纯度。(c（c）)通过使用线粒体的定量PCR确定相对mtDNA拷贝数二氧化碳基因和核GADD45公司基因。数据为平均值±S。三个独立实验的D。(d日)用mTFA-siRNA寡核苷酸（si-mTFA）或打乱的siRNA（si-Con）转染P19SCs后超时检测mTFA表达的代表性免疫印迹。(e（电子）)多能性（OCT4、NANOG和SOX2）和分化（TROMA-1和βP19SCs、P19dCs及其转染对应物si-mTFA和si-Con中的III-tubulin）标记。条形图显示光密度（O.D.）±S的平均值。D.表示为来自至少三个单独免疫印迹的各自si-Con的百分比。Ponceau S用于装载控制。统计比较：*P（P）<0.05
图3
图3
RA诱导细胞分化后，P19细胞的线粒体变得更加极化和功能化。(一)标记有TOM20和MitoTracker Red（MTR）的P19SC和P19dC的共焦图像。P19SC的线粒体用线粒体标记TOM20染色，但不加载MTR。DAPI标记细胞核。比例尺=15 μ米(b条)用电位染料TMRM获得的共焦图像显示了P19SC分化后线粒体结构和膜电位的明显变化。与TMRM和MitoTracker Green（MTG）共同加载的P19细胞在FCCP去极化前后的图片（2 μM） 证实添加FCCP后，P19SC中的线粒体几乎不显示。比例尺=15 μ米(c（c）)P19SC中解偶联蛋白2（UCP-2）的蛋白水平较高。条形图显示了光密度（外径）±S的平均值。D(n个=7）表示为P19SC的百分比*P（P）<0.05. (d日)基本耗氧量显示为O的nmol2每分钟和每106P19dCs的细胞数高于P19SC。十μ添加M FCCP以测试最大呼吸。HPLC测定的ATP、ADP和AMP表明P19dC中的ATP生成量和ATP/ADP比率升高。用1.3处理的细胞中ATP水平的百分比 μg/ml寡霉素或100 mM 2-脱氧葡萄糖（2-DG）3 h显示在两种类型的P19细胞中ATP的产生仅对2-DG敏感。数据为平均值±S。D.用于n个=6个实验*P（P）<0.05; **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001
图4
图4
P19SC的分化重塑了线粒体OXPHOS装置和线粒体通透性转换孔（mPTP）的成分。(一)在P19SC和P19dCs中分析了五种复合物（NDUFB8、SDHB、UQCRC2、MTCO1和ATP5A）的OXPHOS亚基。Ponceau S用于装载控制。条形图显示了光密度（外径）±S的平均值。D.表示为至少三个单独实验中P19SC的百分比*P（P）<0.05. (b条)P19SC和P19dCs中的MitoSOX荧光图像显示P19dC中线粒体超氧阴离子生成量显著增加。比例尺=15 μ米(c（c）)腺嘌呤核苷酸转运体（ANT）、电压依赖性阴离子通道（VDAC）和亲环素D（CyP-D）蛋白含量在P19SCs和P19dCs之间有显著变化。Ponceau S用于载荷控制，直方图显示光密度（O.D.）±S的平均值。D.表示为三个独立实验中P19SC的百分比***P（P）<0.001。(d日)流式细胞术测量钙黄绿素荧光的钴淬灭作为mPTP开放的终点，结果显示P19SC中的构象比P19dC更为紧密。环孢菌素A（2 μM） 仅能抑制P19SC中的孔隙开放。离子霉素（0.5 μM） 用于诱导孔隙开放。数据显示为相对荧光单位（RFU），代表几何平均值±S的平均值。D.，归一化为与钙黄绿素孵育的细胞的荧光n个=3. ***P（P）<0.001。(e（电子）)钙的细胞内（用Fluo-4荧光检测）和线粒体（用Rhod-2荧光检测）测量2+水平显示细胞内游离钙浓度较高2+在P19dCs中。数据为平均值±S。至少三个单独的实验*P（P）<0.05, **P（P）<0.01. (（f）)评估Ca2+线粒体的保留能力，负载Rhod-2的P19细胞在第5分钟用10刺激 μM离子霉素（Iono）随后对Rhod-2信号进行荧光评估。显示了说明ΔRFU（第15分钟-第5分钟）的代表性记录道和定量数据。数据为平均值±S。D.、。，n个=5. *P（P）<0.05
图5
图5
P19SC表现出强烈的糖酵解特征。(一)[3的外观-13C] -（乳酸-13C） 和非丰富（Lac-12C） 培养基中的乳酸1核磁共振氢谱。(b条)通过以下方法测量培养基中标记葡萄糖水平的降低1核磁共振波谱。(c（c）)P19SC和P19dCs培养期间乳酸生成量的比较。数值为平均值±S。E.M.来自n个=6个实验***P（P）<0.001。(d日)P19SC和P19dCs葡萄糖消耗量的比较。数据为平均值±S。E.M.来自n个=6个实验*P（P）<0.05. (e（电子）)1P19SCs（底部）和P19dCs（顶部）细胞提取物的H-NMR代谢谱。(（f）)13P19SCs（底部）和P19dCs（顶部）细胞提取物的C-NMR光谱。(克)线粒体（m）和细胞溶质（c）提取物中己糖激酶II（HKII）的蛋白表达显示P19SC中线粒体结合己糖激酶Ⅱ较高。TOM20被用作负荷控制，以验证线粒体分离。条形图显示光密度（外径）±S的平均值。D.表示为从三个单独的实验中检测到的P19SCs（丝裂原19SCs）中线粒体己糖激酶II的百分比*P（P）<0.05
图6
图6
在含有半乳糖（Gal）的培养基中生长的P19SCs增强线粒体活性并分化。(一)上直方图：P19细胞耗氧量：分化（P19dCs）和未分化（P19 SCs），在葡萄糖（Glu）和含Gal介质中生长。添加FCCP以测试最大呼吸，但仅发现Gal-P19dCs的统计差异(†P（P）<0.05). 数据以O的nmol表示2每分钟和每106细胞±S。D.用于n个=6个实验。下直方图：通过流式细胞仪测量TMRM荧光。数据显示为相对荧光单位（RFU），代表几何平均值±S的平均值。D.来自至少三个独立实验。催化裂化装置（2 μM） 作为阴性对照，从未处理值中减去FCCP值。统计比较：*与Glu-P19SC；# 与Gal-P19SC；$ 与Glu-P19dCs。符号的数量标志着统计显著性的水平：一个用于P（P）<0.05，两个用于P（P）<0.01，三个用于P（P）<0.001。(b条)72年期间测量的相对细胞生长 h显示在含半乳糖培养基中生长的P19细胞的增殖率降低。数据表示时间分别为0±S时，硫代罗丹明B吸光度的平均百分比。来自至少三个独立实验。统计比较：*P（P）<0.05与Glu-P19SC；#P（P）<0.05与Gal-P19SC。(c（c）)用MitoTracker红（MTR）和抗NANOG抗体（FITC-绿）染色的P19细胞的共焦图像。Glu-和Gal-P19SCs表达NANOG。P19dCs显示线粒体网络发达，NANOG缺失。比例尺=15 μ米(d日)多能性（OCT4、NANOG和SOX2）和分化（TROMA-1和βIII-管蛋白）标记在所有P19细胞组中。条形图显示了光密度（外径）±S的平均值。D.表示为来自至少三个单独免疫印迹的Glu-P19SCs百分比。使用胭脂红S进行装载控制。统计比较：*与Glu-P19SC；# 与Gal-P19SC；$ 与Glu-P19dCs。符号的数量标志着统计显著性的水平：一个用于P（P）<0.05，两个用于P（P）<0.01，三个P（P）<0.001
图7
图7
P19细胞中的线粒体分化/重塑减弱了糖酵解代谢，使细胞对线粒体毒素和二氯乙酸盐敏感。(一)呼吸链复合物NDUFB8、SDHB、UQCRC2、MTCO1和ATP5A亚单位的表达；线粒体生物发生标志物（PGC1和mTFA）；以及四种类型P19细胞的能量代谢标记物（GAPDH、PDH和PDK）：干细胞（P19SCs）和分化细胞（P19 dCs）系，生长在葡萄糖（Glu）和半乳糖（Gal）介质中。数据是光密度（外径）±S的平均值。D.表示为Glu-P19SC的百分比，来自至少三个单独的实验。统计比较：*与Glu-P19SC；# 与Gal-P19SC；$ 与Glu-P19dCs。符号的数量标志着统计显著性的水平：一个用于P（P）<0.05，两个用于P（P）<0.01，三个P（P）<0.001。(b条)线粒体毒物鱼藤酮（2.5 μM） ，催化裂化装置（2 μM） 和寡霉素（1.3 μg/ml）。Glu-P19SC对FCCP表现出较高的抗性。数据表示为每个时间点的控制百分比（仅限车辆）。数据为平均值±S。E.M.来自n个=5. *P（P）<0.05; **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001与控件。(c（c）)用1、5和10处理的P19细胞的活性 mM二氯乙酸。Glu-P19SC维持其生存能力。数据表示为每个时间点的控制百分比（仅限车辆）。数据为平均值±S。E.M.来自n个=5. *P（P）<0.05; ***P（P）<0.001与控制
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参考文献

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