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.2014年6月;6(6):760-77.
doi:10.1002/emmm.201303626。 Epub 2014年4月6日。

心肌梗死后外源性细胞治疗对内源性成心肌细胞的刺激作用

附属公司

心肌梗死后外源性细胞治疗对内源性成心肌细胞的刺激作用

康斯坦蒂诺斯·马利亚拉斯等。 EMBO分子医学. 2014年6月.

摘要

围绕成年哺乳动物内源性心肌细胞祖细胞的身份、起源和生理作用存在争议。使用可诱导的基因标记方法来鉴定表达心脏标记物的小非心肌细胞,我们发现在正常成年小鼠心脏中激活的内源性成心肌细胞很少明显。然而,心肌梗死导致损伤部位的成纤维细胞显著激活。基因标记的分离成心肌细胞表达心脏转录因子和肌聚蛋白,表现出自发收缩,并在注射到未标记受体心脏后在体内形成成熟的心肌细胞。活化的成心肌细胞并非来源于血细胞播种、心肌细胞去分化或仅仅是预先形成的祖细胞池的扩张。用心脏球衍生细胞进行细胞治疗,部分是通过移植细胞分泌基质细胞衍生因子1来增强先天性心脏成纤维细胞介导的组织再生。因此,外源细胞刺激内源性成心肌细胞可介导损伤心肌的治疗性再生。

关键词:心脏干细胞;成心脏细胞;心肌祖细胞;心球衍生细胞;心脏再生。

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数字

图1
图1。内源性成心肌细胞在心肌梗死后被激活
  1. 研究示意图。使用双转基因Myh6-MerCreMer/ZEG小鼠,在具有α-肌球蛋白重链(αMHC)启动子活性的细胞中,短暂暴露于4OH他莫昔芬诱导从β-半乳糖苷酶表达到绿色荧光蛋白(GFP)表达的不可逆遗传转换,导致αMHC的永久标记+GFP检测细胞。

  2. B酶消化心肌细胞耗尽心肌细胞制备物的侧面散射(SSC)和GFP表达的代表性流式细胞仪图(图像已应用颜色门控)。数字表明各组的平均%GFP阳性。

  3. C GFP量化的汇总数据+通过流式细胞术(FC)和表观荧光显微镜(epi)在假手术(sham)和梗死(MI)小鼠心脏中检测成心肌细胞(*P(P)与假手术组相比<0.05,n个=5只小鼠/组)。

  4. GFP的D荧光显微照片+从梗死心脏中新鲜分离的酶消化心肌细胞耗尽的心肌细胞制剂中的成心细胞。红有序区域在右侧放大(比例尺,10μm)[蓝色:赫斯特,绿色:GFP,亮场(BF)]。

  5. E GFP直径+免疫细胞化学法测定成心肌细胞(n个=30个单元格)。

  6. 梗死心脏组织切片的F–H共聚焦显微镜显示激活的GFP数量增加+梗死区的成心肌细胞(F)。梗死区域由心肌细胞缺乏(αSA阴性)和非心肌细胞存在(αSA/DAPI公司+)单元格。GFP公司+远心心肌(G,H)中的成心肌细胞很少(*P(P)与远程相比<0.05,n个=4只小鼠)。观察到常驻心肌细胞(也表达αMHC)的部分标记。右侧的图像是左侧标记区域的放大图像。还提供了XZ平面上的共焦扫描图像[蓝色:DAPI,绿色:GFP,红色:α-肌聚肌动蛋白(αSA)]。

  7. 荧光免疫细胞化学显示GFP+成心肌细胞为lacZ阴性,证实了从β-半乳糖苷酶表达到GFP表达的基因转换(蓝色:DAPI,绿色GFP,红色:lacZ)。

图2
图2。内源性成心肌细胞表现出自发收缩,并表达心脏转录因子、肌体和循环蛋白
  1. GFP的静态图像+表现出自发收缩活性的成心细胞在体外培养1天后(相应电影见补充电影S1和S2)(比例尺,10μm)[绿色:GFP,亮场(BF)]。

  2. FACS分类GFP的荧光免疫细胞化学+用于心脏转录因子NKX2-5、GATA4和MEF2C核表达的成心细胞。注意GFP细胞(中间和右侧面板,因GFP的FACS不完善而导致)对心脏转录因子呈阴性(蓝色:DAPI,绿色:GFP,红色:NKX2-5,GATA4,MEF2C)。

  3. FACS分类GFP的荧光免疫细胞化学+用于α-肌动蛋白(αSA)和α-肌球蛋白重链(αMHC)细胞质表达的成心肌细胞。右侧图像显示绿色荧光蛋白+成心细胞在细胞质中表达αMHC,在细胞核中表达NKX2-5。注意GFP细胞(左侧面板)不表达肉质蛋白(蓝色:DAPI,绿色:GFP,红色:αSA/αMHC)。

  4. GFP中心脏转录因子和肉质蛋白表达的定量+荧光免疫细胞化学法检测成心肌细胞(n个=4只小鼠)。在GFP中未检测到TBX5或ISL1的表达+细胞。

  5. FACS分类GFP的荧光免疫细胞化学+Ki67和磷酸化组蛋白H3(H3P)的成心肌细胞。注意GFP电池为Ki67(左侧面板)和GFP+分裂成心细胞在两个细胞核中表达H3P(右图)(蓝色:DAPI,绿色:GFP,红色:Ki67/αSA,白色:H3P)。

  6. 共聚焦显微镜显示GFP的存在+成心肌细胞似乎在边界区经历有丝分裂。右边的图像是左边突出显示区域的放大图像。还提供了穿过XZ平面的共焦扫描图像(蓝色:DAPI,绿色:GFP,红色:αSA)。

  7. GFP中循环蛋白表达的定量+荧光免疫细胞化学法检测成心肌细胞(n个=4只小鼠)。

图3
图3。内源性成心肌细胞中心脏转录因子、心源性分子和心脏结构因子的基因表达
FACS分选GFP提取RNA的RT-qPCR+和GFP去肌细胞的心肌细胞显示GFP中心源性分子(NKX2-5、MEF2C、TBX3、FOXC2和BMP2)和心脏结构因子(MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、TNNI3、TNNT2、MYBPC3、PLN、DES、NPPA、CKM和TTN)的表达增加+成心肌细胞与GFP的比较心脏细胞。与成年心肌细胞相比,GFP+在所有研究的心脏结构因子中(MYH7除外),成心肌细胞NKX2-5的表达较低,MEF2C、TBX3和GATA4的表达相似,BMP2和FOXC2的表达增加。GFP中成纤维细胞(VIM)、内皮细胞(VWF)和平滑肌细胞(ACTA2)相关基因的表达下调+成心脏细胞(*P(P)与GFP相比<0.05细胞,#P(P)与GFP相比<0.05+细胞,n个=5只用于分离FACS分类GFP的小鼠+和GFP非肌细胞,n个=3只小鼠用于成年心肌细胞)。
图4
图4。内源性成心肌细胞中假定心脏干细胞表面标志物的表达
  1. 荧光免疫细胞化学和流式细胞术检测GFP中Sca-1的表达+成心细胞(流式细胞仪图中已应用了颜色门控)(蓝色:DAPI,绿色:GFP,红色:Sca-1)。

  2. 流式细胞术显示<1%的GFP+成心肌细胞(由于应用了色门控技术而出现红点)主动流出Hoechst染料[侧群(SP)细胞]。方框区域表示Hoechst-low SP细胞。与维拉帕米和赫斯特共同孵育的样品作为阴性对照,因为维拉帕米可消除钙依赖性赫斯特挤出。

  3. 荧光免疫细胞化学检测GFP中巢蛋白的表达+内源性成心肌细胞(蓝色:DAPI,绿色:GFP,红色:nestin)。

  4. 量化先前用于鉴定GFP中假定内源性心脏干细胞的表面标记的表达+荧光免疫细胞化学法检测成心细胞(n个=3只小鼠)。GFP公司+c-kit、SSEA1和PDGFRα均为阴性。

图5
图5。内源性成心肌细胞移植到受体心脏后分化为成熟心肌细胞
  1. 研究示意图。FACS分类GFP+将心肌梗死后激活的成纤维细胞注射到无损伤的(n个=3)或梗死(n个=3)非转基因背景小鼠的心脏。

  2. 未受损心脏组织切片的共焦显微镜显示GFP的罕见病例+注射后3个月心肌细胞。GFP公司+心肌细胞表现为完全成熟,并通过缝隙连接[connexin 43(Cx 43)]与相邻的GFP连接肌细胞。右边的图像是左边高亮区域的高倍图像[蓝色:DAPI,绿色:GFP,红色:α-肌动蛋白(αSA),紫色:Cx 43]。

  3. GFP的荧光显微照片+在Langendorff装置上对未受损心脏进行酶解后的心肌细胞。右边的图像是左边插入的高倍图像(比例尺,50μm)[绿色:GFP,亮场(BF)]。

  4. 梗死心脏组织切片的共焦显微镜显示GFP的罕见病例+注射后3个月梗死边缘区的心肌细胞(蓝色:DAPI,绿色:GFP,红色:αSA)。

图6
图6。内源性成心肌细胞的起源
  1. 研究示意图。将Myh6-MerCreMer的骨髓移植到受致命照射的非转基因背景小鼠中。将骨髓重塑小鼠随机分为假手术组和MI组,然后进行4OH-氨甲氧基芬脉冲治疗。

  2. 通过免疫组织化学(左)和免疫细胞化学(右)在梗死区很容易检测到LacZ细胞,表明骨髓重建成功(蓝色:DAPI,绿色:GFP,红色:αSA,白色:LacZ)。

  3. 酶消化去肌细胞心肌细胞制剂的侧面散射(SSC)和GFP表达的代表性流式细胞术图(图像已应用彩色门控)。数字表明各组的平均%GFP阳性。

  4. GFP的量化+通过流式细胞术(FC)和表观荧光显微镜(epi)对骨髓再构成小鼠的假手术心脏和梗死心脏进行成心肌细胞检测。不是一个GFP+用荧光显微镜检测细胞(n个=4-5只小鼠/组)。

  5. 研究示意图。预先用4OH-氨甲氧基芬脉冲处理的双转基因小鼠随机接受假手术或心肌梗死。

  6. 酶消化去肌细胞心肌细胞制剂的侧面散射(SSC)和GFP表达的代表性流式细胞术图(图像已应用彩色门控)。数字表明各组的平均%GFP阳性。

  7. GFP的量化+流式细胞术(FC)和表观荧光显微镜(epi)检测预脉冲双转基因小鼠假手术心脏和梗死心脏的成心肌细胞(*P(P)与假手术组相比<0.05,n个=3-5只小鼠/组)。

图7
图7。心肌梗死后SDF1依赖性心球衍生细胞介导的内源性成纤维细胞上调
  1. 酶消化心肌细胞耗尽心肌细胞制备物的侧面散射(SSC)和GFP表达的代表性流式细胞仪图(图像已应用颜色门控)。数字表明各组平均%GFP阳性(左)。GFP的量化+通过流式细胞术(FC)和表观荧光显微镜(epi)对假手术(sham)、梗死(MI)和细胞处理(CDCs)小鼠心脏中的成心肌细胞进行检测(*P(P)与假手术组相比<0.05,#P(P)<0.05至MI,n个=3-5只小鼠/组)。

  2. B、 GFP中CXCR4(B)和VEGFR1(C)受体的荧光免疫细胞化学和定量+成心肌细胞(蓝色:DAPI,绿色:GFP,红色:CXCR4/VEGFR1)(n个=3只小鼠)。

  3. D-G敲除SDF1和VEGF导致在体外SDF1(D)和VEGF(E)的产生(*P(P)与sh-对照转导的CDC相比,<0.05,n个=3),心肌SDF1(F)和VEGF(G)水平降低体内MI和注射shRNA-转导的CDC后4天(*P(P)与MI相比<0.05,#P(P)与shSDF1或shVEGF转导的CDC相比<0.05,n个=3只小鼠/组)。

  4. H用于侧散射(SSC)和GFP表达的酶消化的心肌细胞贫化的心肌细胞制剂的代表性流式细胞术图(已将颜色门控应用于图像)。数字表明各组平均%GFP阳性(左)。GFP的量化+通过流式细胞术(FC)和表观荧光显微镜(epi)对注射sh-对照、sh-SDF1-和sh-VEGF-转导的CDC的梗死心脏的成心肌细胞进行检测(*P(P)与shSDF1转导的CDC相比<0.05,n个=5只小鼠/组)。

图8
图8。心球来源细胞对内源性祖细胞介导的心脏再生的治疗性刺激至少部分依赖于SDF1的分泌
  1. 心肌梗死后5周,Masson的毛染色梗死小鼠心脏的典型图像。存活心肌染色为红色,而疤痕染色为蓝色。每个心脏有五个连续切片(从LAD结扎水平到心尖,以500-μm的间隔获得)。右侧的图像是左侧方框区域的高倍图像,显示与sh-SDF1 CDC治疗的心脏相比,sh-对照CDC治疗心脏梗死区域的存活心肌增加。梗死对照组(右)的疤痕主要是跨壁的。

  2. 心脏的B-E形态分析,用于量化瘢痕块(B)、存活块(C)、瘢痕通透性(D)和梗死区存活率(E)(*P(P)与MI相比<0.05,#P(P)与shSDF1转导的CDCs相比<0.05,n个=5只小鼠/组)。

  3. F左室功能的超声心动图评估(*P(P)与MI相比<0.05,#P(P)与shSDF1转导的CDC相比<0.05,n个=5只小鼠/组)。

  4. G sh-对照CDC治疗心脏、sh-SDF1 CDC治疗的心脏、梗死对照心脏和假手术心脏边缘区的代表性荧光免疫组织化学图像(左)。GFP百分比的量化+边缘区(右侧)的心肌细胞显示GFP的稀释更为明显+GFP测定的心肌细胞池与sh-SDF1 CDC治疗的心脏和梗死对照心脏相比,sh-对照CDC治疗心脏中的心肌细胞表明内源性祖细胞(∧P(P)与假手术组相比<0.05*P(P)与MI相比<0.05,#P(P)与shSDF1转导的CDC相比<0.05,n个=5-6只小鼠/组)(蓝色:DAPI,绿色:GFP,红色:αSA)。

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