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.2014年5月1日；10（5）：e1004098。
doi:10.1371/journal.ppat.1004098。 eCollection 2014年5月。

诱导卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染细胞基因组不稳定的新机制

布莱恩·杰克逊 1, 马克·诺伦伯格 1, 阿德里安·怀特豪斯 1
附属公司

诱导卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染细胞基因组不稳定的新机制

布莱恩·杰克逊等。 公共科学图书馆-病理学. .

摘要

卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）是一种与多种艾滋病相关恶性肿瘤相关的致癌疱疹病毒。与其他疱疹病毒一样，KSHV具有双相生命周期，肿瘤发生需要溶解期和潜伏期。证据表明，KSHV裂解复制可导致KSHV感染细胞的基因组不稳定，尽管迄今为止尚未描述其机制。最近有人提出，mRNA输出、基因组不稳定性和癌症发展之间存在令人惊讶的联系。值得注意的是，细胞转录和输出复合物（hTREX）蛋白的异常已在高级别肿瘤中发现，这些缺陷导致基因组不稳定。我们之前已经证明，溶解表达的KSHV ORF57蛋白与完整的hTREX复合物相互作用；因此，我们研究了ORF57、hTREX和KSHV诱导的基因组不稳定性之间可能存在的有趣联系。在这里，我们表明，溶解活性KSHV感染细胞诱导DNA损伤反应，重要的是，我们直接证明这是由于DNA链断裂。此外，我们发现KSHV ORF57蛋白对hTREX复合物的隔离导致这种双链断裂反应和显著的DNA损伤。此外，我们描述了一种新的机制，表明观察到的遗传不稳定性是R-环形成的结果。重要的是，hTREX隔离和DNA损伤之间的联系可能是疱疹病毒感染的常见特征，因为在单纯疱疹病毒1（HSV-1）ICP27蛋白中观察到类似的表型。我们的数据提供了一个R-loop诱导KSHV感染细胞DNA损伤的模型，并描述了一个用于研究异常hTREX引起的基因组不稳定性的新系统。

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数字

图1
图1。KSHV裂解活化诱导双链断裂反应，并形成DNA断裂。
(A类)，TREx BCBL Rta细胞保持未激活状态或重新激活24小时并固定免疫荧光。然后使用ORF57单克隆抗体对细胞进行染色，以显示其重新激活，使用γH2A.x单克隆抗体显示DNA损伤部位。(B类)诱导后0、8、16和24小时内活化的TREx BCBL Rta细胞中蛋白质表达的时间进程。使用针对GAPDH的单克隆抗体显示等负荷，使用针对Rta和ORF57的Myc单克隆抗体来显示KSHV重新激活。为了证明DNA损伤，使用多克隆抗体显示H2A.x的总水平，并使用磷酸化形式的单克隆抗体γH2A.x(C类)对于彗星分析，TREx-BCBL-Rta细胞被重新激活24小时，并使用针对Rta的Myc和ORF57的单克隆抗体通过western blot评估重新激活。抗GAPDH的单克隆抗体也用于显示等负荷。(天). 使用CometCore和计算的尾部力矩进行彗星分析并评分(E类); n-和P（P）-数值如图所示，误差条显示平均值的标准误差。
图2
图2。ORF57表达细胞的染色体不稳定性。
(A类)iORF57 293细胞保持未诱导或诱导24小时，然后固定在盖玻片上并用DAPI染色DNA。共聚焦显微镜用于鉴定和成像有丝分裂细胞。显示了未诱导和诱导细胞的三个代表性图像，合并图像包括相位对比图像。诱导样品中滞后的染色体用白色箭头突出显示。(B类)将转染或转染EGFP或EGFP-ORF57的HEK 293T细胞模拟细胞固定在盖玻片上，并用DAPI染色以进行有丝分裂细胞成像。EGFP-ORF57表达细胞中滞后的染色体以白色箭头突出显示。
图3
图3。ORF57表达通过H2A.x磷酸化诱导DNA损伤反应。
(A类)iORF57 293细胞要么未被诱导，用50µM依托泊苷处理30分钟以诱导DSBs，要么被诱导表达ORF57，固定在盖玻片上并通过共聚焦显微镜观察。使用针对Flag的多克隆抗体检测ORF57，并使用针对γH2A.x的单克隆抗体显示DSB细胞。(B类)iORF57 293细胞未诱导，用50µM足叶乙甙处理30分钟，或诱导48小时。收集细胞裂解物并进行蛋白质印迹分析。使用GAPDH单克隆抗体显示等负荷，使用Flag多克隆抗体显示ORF57表达，使用γH2A.x单克隆抗体证明DSB。(C类)iORF57 293细胞未诱导或诱导48小时，并进行碱性彗星试验。(天)使用彗星核心和计算出的尾部力矩对彗星进行评分。n-和P（P）-数值如图所示，误差条显示平均值的标准误差。
图4
图4。ORF57在中性彗星实验中诱导双链断裂。
进行中性彗星分析以评估双链断裂。(A类)用50µM足叶乙甙处理细胞15分钟作为阳性对照，用mCherry转染细胞，或用mCherly-ORF57转染细胞并用荧光显微镜分析以评估转染效率。(B类)使用GAPDH单克隆抗体作为负荷对照，使用RFP多克隆抗体检测mCherry和mCherry-ORF57的表达，通过western blot评估蛋白表达。(C类)使用CometScore和(天)计算了尾部力矩。显示了N和p值，误差条表示平均值的标准误差。
图5
图5。ORF57诱导的双链断裂是R环形成和hTREX隔离的结果。
(A类)对HEK 293T细胞进行碱性彗星试验，并使用GAPDH单克隆抗体作为负荷对照，通过western blot评估每次试验的蛋白质水平；抗Myc-Aly单克隆抗体；抗GFP单克隆抗体ORF57pMut、EGFP-RNaseH1和EGFP-AID；mCherry和mCherry-ORF57的RFP多克隆抗体。(B类)用mCherry或mCherry-ORF57转染细胞，或用50µM足叶乙甙处理30分钟作为阳性对照，通过荧光显微镜观察以确认转染效率(我); 使用CometScore进行彗星分析并评分(ii（ii）); 和计算的尾部力矩(三). (C类)为了证明R-环的形成，用mCherry-ORF57和pMSCVgfp:：AID或pEGFP-RNH共转染细胞，通过荧光显微镜观察以确认转染效率(我); 使用CometScore进行彗星分析并评分(ii（ii）); 和计算的尾部力矩(三). (天)为了证明ORF57对hTREX的隔离是R-loop形成的原因，用pEGFP-57pmut转染细胞或用mCherry-ORF57和Myc-Aly联合转染细胞，通过荧光显微镜观察以确认转染效率(我); 使用CometScore进行彗星分析并评分(ii（ii）); 和计算的尾部力矩(三). n-和P（P）-图中显示了所有数据的值，误差条显示了平均值的标准误差。
图6
图6。溶血复制的KSHV细胞证明存在R环。
(A类)293T rKSHV.219细胞要么保持未激活状态，要么重新激活36小时，然后转染Myc-Aly或EGFP-RNaseH1，并进行碱性彗星试验。(B类)彗星尾巴使用CometScore和n-和P（P）-代表所有数据的值，误差条显示平均值的标准误差。
图7
图7。HSV-1 ICP27通过hTREX募集诱导R-loop介导的DNA损伤。
(A类)用EGFP、EGFP-ICP27、EGFP-ICP27WRL转染HEK 293T细胞，或EGFP-ICP27与Myc-Aly、EGFP-RNaseH1或pMSCVgfp:：AID的双重转染进行24小时碱性彗星测定。(B类)彗星尾巴使用CometScore和n-和P（P）-代表所有数据的值，误差条显示平均值的标准误差。
图8
图8。ORF57隔离hTREX如何导致R环和基因组不稳定的模型。
在健康细胞中，hTREX的成分在转录和剪接的连锁过程中被招募到细胞前mRNA中。然后这些成分起作用稳定新转录的mRNA。当hTREX通过突变或siRNA变得无功能时，新转录的RNA可能变得不稳定，并退火到DNA形成R环的模板链，导致DNA链断裂增加。在KSHV感染或外源性ORF57表达期间，ORF57招募hTREX复合体，基本上复制突变hTREX系统，导致基因组不稳定性增加。
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