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.2014年4月29日;12(4):e1001847。
doi:10.1371/journal.pbio.1001847。 eCollection 2014年4月。

逆转录酶复合体是视紫红质循环所必需的,其丢失会导致感光细胞退化

附属公司

逆转录酶复合体是视紫红质循环所必需的,其丢失会导致感光细胞退化

Shiuan Wang(王世安)等。 公共科学图书馆生物. .

勘误表in

摘要

视紫红质误吸可导致光感受器(PR)退化。在光照下,果蝇PRs中激活的视紫红质1(Rh1)通过内吞作用被内吞并在溶酶体中降解。内化Rh1能否回收尚不清楚。在这里,我们发现逆转录酶复合物在PR中表达,在光刺激下回收内吞的Rh1是必需的。在缺乏逆转录酶亚单位的情况下,Rh1在内溶酶体途径中进行处理,导致晚期内体、溶酶体和光依赖性PR变性急剧增加。减少逆转录突变体中的Rh1内吞或Rh1水平可缓解PR退化。此外,增加逆转录体丰度可抑制影响内溶酶体系统的突变的退化表型。最后,表达人Vps26可抑制Vps26突变PR中的PR退化。我们认为逆转录酶在回收视紫红质以维持PR功能和完整性方面起着保守作用。

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利益冲突声明

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数字

图1
图1。眼部Vps26缺失会导致PR退化。
(A) 显示与内胚体膜相关的逆转录酶复合体的示意图。Snx3和Rab7A将Vps35-29-26三聚体招募到内体。Vps35是逆转录酶中Vps26的蛋白伴侣之一。Vps26的arrestin-like结构域和Vps35的α螺线管结构域与人类同源物对齐。(B) ERG控制痕迹(iso)和电压261第0天的马赛克眼睛,保持在LD(光强度 = 1800勒克斯),持续2、10和21天;电压261通过EGFP标记的基因组拯救构建物(GR,Vps26-gEGFP型)在LD中保存21天;电压261在DD中保存21天。UAS-RNAi针对w个基因产物在获救动物的眼睛中表达(电压261GR或电压262GR)去除红色颜料。LD中的通断瞬态消失,振幅在2d后减小,但在DD中保持3周后保持不变。通断瞬态的损失和去极化的减少可以通过Vps26 gEGFP救援建筑。(C) LD或DD中苍蝇ERG振幅的量化。在指定的时间点为每个基因型记录10条ERG轨迹。ERG振幅标准化,以控制第0天记录的PR。的光响应电压261(或电压262)在LD中保存的突变体和在指定时间点DD中保存的突变体之间进行比较。学生的t吨测试;误差条代表SEM**第页<0.01. (D) 控制的亮场部分,电压261,并获救电压261苍蝇在LD中停留指定时间,或电压ps261在DD中保存21天。UAS-w个RNAi在获救动物中表达。新关闭的电压261突变体大多是正常的,但偶尔会出现杆状体缺失。的PR电压261在LD中21天后严重受损,但在DD中基本保持完好Vps26-gEGFP型救援结构拯救PR退化电压261突变体。比例尺,2µm。(E) (D)中完整杆状体数量的量化。对三只动物的30只小蜂进行了每种基因型的检测。学生的t吨测试;误差棒为SEM**第页<0.01; ns,无显著性。(F) 分子损伤电压26两个等位基因的突变改变了arrestin-like结构域中高度保守的氨基酸残基。
图2
图2。Vps35缺失导致PR变性。
(A) Vps26免疫染色电压35MH20型马赛克无性系由ey-FLP公司检查了三龄幼虫眼象盘中形态发生沟后的分化细胞。对照细胞用GFP标记,而电压35MH20型突变细胞缺乏GFP表达。注意Vps26的损失电压35MH20毫米突变细胞,表明Vps26蛋白的存在依赖于Vps35的存在。比例尺,10µm。(B) ERG控制痕迹(FRT42D型)和电压35MH20型在LD中保存0、4、10或21天,或在DD中保存21天。电压35MH20型PR失去开-关瞬变,在LD中表现出逐渐的振幅损失,但在DD中仅轻度受损。(C)在(B)中测量的苍蝇ERG振幅的量化。在指定的时间点,对每个基因型的10只苍蝇的ERG进行量化。ERG振幅标准化,以控制LD第0天记录的PR。去极化比较电压35MH20型在指定时间点保存在LD和DD中的突变PR。学生的t吨测试;误差条代表SEM**第页<0.01. (D) 控件和电压35MH20型在指定的时间段内保存在LD中,或电压35MH20型在DD中饲养21d。黑暗饲养电压35MH20型突变体在第0天表现出正常的PR形态。的PR电压35MH20型在LD中21天后严重受损,但在DD中基本保持完整。比例尺,2µm。(E) (D)中完整杆状体数量的量化。对三只动物的30只小蜂进行了每种基因型的检测。学生的t吨测试;误差条代表SEM**第页<0.01; ns,无显著性。
图3
图3。晚期内体和溶酶体在电压26电压35突变PRs。
(A) 对照(iso)苍蝇在LD中保存4d后,其PR的TEM显示出正常形态,杆状体和细胞体完整。比例尺,1.5µm。(B) 在LD中的第4天,电压261突变型PR表现出高度异常的形态特征:注意晚期内体(多泡结构,插图1)和溶酶体(浓缩结构,插图2)的扩张。此外,与(A)中的对照相比,电子致密颗粒增加,一些杆状体的形态有缺陷。比例尺,1.5µm。(C) DD第4天,电压261突变型PR表现出与对照相似的形态。比例尺,1.5µm。(D) 在LD中的第4天,电压35MH20型突变的PRs显示晚期内体(插图1)和溶酶体(插图2)增加,类似于电压261突变体。比例尺,1.5µm。(E) 在DD中4 d时电压35MH20型突变的PRs与对照组相似。比例尺,1.5µm。(F) 定量LD或DD中第4天PR中晚期内体和溶酶体的数量。每个基因型定量10个PR。学生的t吨测试;误差条代表SEM**第页<0.01.
图4
图4。内部化的Rh1积聚于电压26突变体。
(A) Rh1异常分布于电压261突变体。暗养控制(iso)或电压261突变体置于黑暗中,暴露于全谱光下12小时,或暴露于光下12 h,并在黑暗中恢复6小时电压261突变体PRs显示出正常的Rh1分布,其特征是横纹肌体周围的新月形Rh1染色模式(以F-actin标记)(顶部面板)。Rh1在杆粒周围呈新月形的定位是由于杆粒中膜的紧密堆积。在12小时的光照下,随着一些Rh1被内吞,这两种基因型在PR细胞体(中间面板)中都显示出Rh1蛋白水平增加。然而,在黑暗中恢复6小时后,细胞体内的Rh1信号在电压261而非野生型PR(底部面板)。比例尺,2µm。(B) 内吞Rh1优先与Rab7(晚期内吞标记)或Lamp1::GFP(溶酶体标记)共定位。显示Rh1脉冲相分析的示意图。Rh1内化由20分钟蓝光(BL)脉冲诱导,随后5分钟橙光(OL)照射使Rh1失活。随后,将苍蝇在黑暗中放置4小时,以便将Rh1输送至内体隔室。w个RNAi在Lamp1::GFP表达对照或电压261苍蝇。苍蝇PR用指骨肽(标记F-actin)、Rh1、Rab7或GFP染色。Rh1在Rab7(箭头1-3)或Lamp1::GFP(箭头4-6)中富集电压261公关。(C) 对照组和对照组中与Rab7或Lamp1::GFP共定位的Rh1斑点的定量电压261突变PRs。对每种基因型的五只动物中的三十只小蜂进行了量化。学生的t吨测试;误差条代表SEM*第页<0.05; **第页<0.01.
图5
图5。Rh1水平在电压26内化后的突变PRs。
(A) 对照(iso)和电压ps261突变PRs。将苍蝇置于黑暗中,暴露于白光下16小时以诱导Rh1的内吞作用和溶酶体降解,或暴露于16小时白光下并允许其在黑暗中恢复6小时电压261突变体显示出相似的Rh1水平。白光照射16小时后,Rh1水平电压261比对照组减少更多。在黑暗中恢复后,控制和电压261突变体表现出可比的Rh1水平。我们在每条车道上装载了0.4个飞头。(B) 定量Rh1水平归一化为TRP。进行了三个独立实验。学生的t吨测试;误差条代表SEM*第页<0.01; ns,无显著性。(C) ERG痕迹电压261马赛克蝇在黑暗中或暴露于光下16小时,然后在黑暗中恢复6小时电压261突变PR在暴露于这些光照范式时不会受损。(D) (C)中ERG振幅的量化。对每种情况下10只苍蝇的ERG进行量化。ERG振幅标准化为深红色电压261突变PR。误差线代表SEM;ns,无显著性。(E) Rh1与对照PR中的Vps26共定位。Rh1内化由图4B中使用的脉冲相位协议诱导。在黑暗中恢复2小时后,对照PR用Rh1和Vps26抗体染色。多个Rh1点状物与Vps26共定位。
图6
图6。降低Rh1水平抑制PR变性电压26突变体。
(A) 温度敏感性动力蛋白突变降低内吞作用(ts秒)抑制与Vps26丢失相关的ERG缺陷。动物在18°C的温度下黑暗生长。选择新封闭的苍蝇,并在24°C的条件下在黑暗中再保持12小时,以降低ts1号机组电压261,是ts1号机组随后,将苍蝇转移到LD或在24°C下保存在DD中。ERG在第四个LD循环结束时执行。ts1号机组苍蝇表现出正常的ERG反应。ERG缺陷电压261当dynamin功能部分降低时,突变PR被抑制,因为电压261,是ts1号机组双突变体的去极化作用强于电压261(B)(A)中测试苍蝇ERG振幅的量化。在完成第四个光周期后,对每个基因型的十只苍蝇进行了测量。ERG振幅标准化为控制(iso)。学生的t吨测试;误差条代表SEM*第页<0.05; **第页<0.01; ns,无显著性。(C) 减少Rh1抑制ERG缺陷电压261突变体。杂合的Rh1型17突变体表现出正常的ERG反应。LD中4天后,丢失一份Rh1型基因强烈抑制ERG振幅的降低电压ps261突变体。(D) (C)中测试苍蝇ERG振幅的量化。在第4天,每个基因型记录了10只苍蝇。ERG振幅标准化以进行控制。学生的t吨测试;误差条代表SEM*第页<0.05; **第页<0.01; ns,无显著性。(E) 减少饮食中的维生素A(vitA)可强烈抑制PR变性电压ps261突变体。降低vitA会降低视网膜水平,这是Rh1成熟所必需的。因此,视网膜丢失导致Rh1丢失。亮场图像显示PR退化在电压261当苍蝇在LD中饲养10天时,在低维生素a含量的食物上饲养的突变体。由于维生素a是Rh1成熟的关键成分,而Rh1是杆状体的关键结构成分,所以当苍蝇饲养在低维生素a食物上时,杆状体大小会大大减小。普通、普通的苍蝇食物;低维生素A、低维生素A的苍蝇食品。比例尺,2µm。(F) (E)中描述的苍蝇完整杆状体数量的量化。对三只动物的30只小蜂进行每种基因型的检测。学生的t吨测试;误差条代表SEM**第页<0.01; ns,无显著性。(G) 定量ERG控制振幅和电压26110天后,在LD中用普通或低维生素A的苍蝇食物饲养。针对相应的基因型和条件,测量了10条ERG痕迹。将振幅标准化,以控制用普通食物饲养的苍蝇。学生的t吨测试;误差条代表SEM**第页<0.01; ns,无显著性。
图7
图7。增加Vps35或Vps26水平可抑制与PLC和AP-μ3突变体相关的PR退化。
(A) 显示突变影响PLC的示意图(norpA(正常值A))或AP-3复合物的μ3亚基(厘米)由于Rh1在后期内体中积累,导致PR退化。(B) F-actin免疫染色标记对照视网膜中的杆粒(w个1118,左侧面板),norpA(正常值A)第24页突变体(左中面板),norpA标准第24页;actin-GAL>UAS-Vps35,UAS-w RNAi(右中面板),或norpA(正常值A)第24页;actin-GAL>UAS-Vps26,UAS-w RNAi(右图)在连续暴露于全光谱光6天后飞行。杆状体的数量和小蜂的组织norpA(正常值A)第24页突变体在暴露于光照6天后(左中面板)严重减少或受损,但当Vps35(右中面板)或Vps26(右面板)过度表达时,突变体基本上保持完好。OE,过度表达。比例尺,5µm。(C) 定量(B)中所示基因型的每个小体的杆状体数量。对6只动物的60只小蜂进行了每种基因型的检测。学生的t吨测试;误差条代表SEM**第页<0.01. (D) 用F-actin免疫染色标记lacZ过表达对照果蝇视网膜中的杆蛋白(actin-GAL4>UAS-lacZ,左上面板),Vps35(actin-GAL4>UAS-Vps35,顶部中间面板),或Vps26(actin-GAL4>UAS-Vps26,右上面板),或厘米1lacZ过表达突变体(厘米1;actin-GAL4>UAS-lacZ,左下面板),Vps35(厘米1;actin-GAL4>UAS-Vps35,底部中间面板),或Vps26(厘米1;actin-GAL4>UAS-Vps26,右下面板)持续白光照射6天。UAS-w个RNAi在所有动物中共同表达。组织和规模厘米1光照后,突变体的杆粒受到强烈损伤。Vps35或Vps26 OE抑制PR形态缺陷厘米1突变体。比例尺,5µm。(E) 所示基因型中每个小眼鼠的杆状体数量的量化。对6只动物的60只小蜂进行了每种基因型的检测。学生的t吨测试;误差条表示SEM**第页<0.01; ns,无显著性。(F) 控制过表达lacZ的ERG痕迹(actin-GAL4>UAS-lacZ,左上面板),Vps35(actin-GAL4>UAS-Vps35,顶部中间面板),或Vps26(光化-GAL4>UAS-Vps26,右上面板),或厘米1lacZ过表达突变体(厘米1;actin-GAL4>UAS-lacZ,左下面板),Vps35(厘米1;actin-GAL4>UAS-Vps35,底部中间面板),或Vps26(厘米1;actin-GAL4>UAS-Vps26,右下面板)苍蝇。这个w个RNAi在每只动物中共同表达。在光照6天后,苍蝇被转移到黑暗中1天,以避免视觉对光的适应。厘米1突变体显示ERG振幅降低,开-关瞬态损失。Vps35或Vps26 OE部分恢复了通断和ERG振幅。(G) (F)中所示苍蝇ERG振幅的量化。每个基因型记录了10条ERG轨迹。ERG振幅标准化以控制PR。学生的t吨测试;误差条代表SEM*第页<0.05; ns,无显著性。
图8
图8。人类Vps26同源物可以挽救苍蝇ERG的丢失电压26突变体。
(A) ERG控制痕迹(iso),电压261,或电压261普遍表达人类Vps26A的突变体(电压261;actin-GAL4>UAS-hvps26A,UAS-w RNAi)或Vps26B(电压261;actin-GAL4>UAS-hvps26B,UAS-w RNAi). 将苍蝇放在LD中21天。人类Vps26A和Vps26B都挽救了体内ERG的通断瞬变损失和振幅降低电压261突变PRs。(B) 定量21天LD中苍蝇的ERG振幅。ERG振幅标准化以控制PR。学生的t吨测试;误差条表示SEM**第页<0.01. (C) 控件的亮场图像,电压261,或电压261过度表达人类的突变体vps26A或vps26BcDNA。UAS公司-w个RNAi与人类共表达vps26A版vps26B版在中电压261突变体。苍蝇在LD中饲养21天电压261在LD中21天后严重受损,但当人类Vps26同源物过度表达时仍保持完好。比例尺,2µm。(D) (C)中完整杆状体数量的量化。对三只动物的30只小蜂进行了每种基因型的检测。学生的t吨测试;误差条代表SEM**第页<0.01. (E) 模型:逆转录酶在苍蝇PR中回收Rh1。在没有逆转录酶的情况下,在短期光照下,内吞Rh1被困在溶酶体内,内吞的Rh1数量增加,被降解。然而,在长期光照下,Rh1的持续积累导致晚期内体和溶酶体的扩张。内溶酶体途径中的Rh1稳态失衡反过来对PR细胞产生压力,导致PR退化。

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