Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10

doi:10.1038/mt.2014.68

.2014年7月；22(7):1299-1309.

doi:10.1038/mt.2014.68。 Epub 2014年4月30日。

通过静脉输送rAAVrh.8和rAAVrh.10的成年小鼠和通过rAAVrh.10的非人灵长类动物的全球CNS转导

附属公司

¹美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学生物化学与分子药理学系；美国加利福尼亚州帕萨迪纳加州理工学院生物系。
²美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学基因治疗中心；美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学微生物与生理系统系。
^三美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学生物化学与分子药理学系。
⁴美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学生物化学与分子药理学系；河北医科大学第二医院神经内科，石家庄，中华人民共和国。
⁵美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学基因治疗中心；美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学微生物与生理系统系；海德堡大学医学院，德国海德堡。
⁶美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学基因治疗中心；中华人民共和国上海同济大学同济医学院生理学系。
⁷美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学基因治疗中心。
⁸美国马萨诸塞州南堡新英格兰灵长类动物研究中心和哈佛医学院。
⁹美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学基因治疗中心；美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学儿科系。
¹⁰美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学基因治疗中心；美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学微生物与生理系统系；南达科他州立大学药学系，美国南达科他的布鲁金斯。
¹¹美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学神经病学系。
¹²美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学生物化学与分子药理学系。电子地址：zuoshang.xu@umassme.deu。
¹³美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学基因治疗中心；美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学微生物与生理系统系；中华人民共和国成都，四川大学华西医院生物疗法国家重点实验室。电子地址：guangping.gao@umassmed.edu。

PMID： 24781136
预防性维修识别码：项目经理4089005
内政部： 10.1038/mt.2014.68

通过静脉输送rAAVrh.8和rAAVrh.10的成年小鼠和通过rAAVrh.10的非人灵长类动物的全球CNS转导

杨斌（Bin Yang）等。分子治疗. 2014年7月.

.2014年7月；22(7):1299-1309.

doi:10.1038/mt.2014.68。 Epub 2014年4月30日。

作者

附属公司

¹美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学生物化学与分子药理学系；美国加利福尼亚州帕萨迪纳加州理工学院生物系。
²美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学基因治疗中心；美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学微生物与生理系统系。
^三美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学生物化学与分子药理学系。
⁴美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学生物化学与分子药理学系；河北医科大学第二医院神经内科，石家庄，中华人民共和国。
⁵美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学基因治疗中心；美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学微生物与生理系统系；海德堡大学医学院，德国海德堡。
⁶美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学基因治疗中心；中华人民共和国上海同济大学同济医学院生理学系。
⁷美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学基因治疗中心。
⁸美国马萨诸塞州南堡新英格兰灵长类动物研究中心和哈佛医学院。
⁹美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学基因治疗中心；美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学儿科系。
¹⁰美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学基因治疗中心；美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学微生物与生理系统系；南达科他州立大学药学系，美国南达科他的布鲁金斯。
¹¹美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学神经病学系。
¹²美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学生物化学与分子药理学系。电子地址：zuoshang.xu@umassme.deu。
¹³美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学基因治疗中心；美国马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学微生物与生理系统系；四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室，成都，中华人民共和国。电子地址：guangping.gao@umassmed.edu。

PMID： 24781136
预防性维修识别码：项目经理4089005
内政部： 10.1038/mt.2014.68

摘要

一些重组腺相关病毒（rAAV）可以跨越新生儿血脑屏障（BBB），有效地转导中枢神经系统（CNS）细胞。然而，在成人中枢神经系统中，系统传递的rAAV的转导水平显著降低，限制了其用于中枢神经系统基因治疗的潜力。在这里，我们描述了静脉注射后成年小鼠中枢神经系统中12种不同的rAAVEGFP。我们表明，跨越成人BBB并实现广泛的中枢神经系统转导的能力是所测试的AAV血清型的一个共同特征。值得注意的是，rAAVrh.8是在具有临床重要性的区域（如皮层、尾壳核、海马、胼胝体和黑质）中对胶质细胞和神经元细胞类型进行稳健全局转导的主要载体。与其他主要载体相比，它还表现出周围组织向性降低。此外，我们评估了rAAVrh.10有无microRNA（miRNA）调节的外周组织表达去靶向性，以将系统性基因传递到绒猴的中枢神经系统。我们的结果表明，rAAVrh.8以及rh.10和9最有希望开发新的治疗策略来治疗成人患者中的神经疾病。此外，全身递送的rAAVrh.10能有效地转导中枢神经系统，其转基因表达可被成年绒猴内源性miRNAs限制在外周。

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数字

图1
**12种rAAV在成年小鼠脑内的一般转导特性**.rAAV型*EGFP公司*在4岁时将s注射到10周龄小鼠的尾静脉 × 10¹²每只小鼠的基因组拷贝数(n个= 3). 注射后21天获得40微米的中枢神经系统（CNS）组织冰冻切片，并用EGFP抗体染色。用亲和素-生物素复合物/3,3′-二氨基联苯胺底物系统观察染色。显示的是bregma-2.00的合成图像根据EGFP半定量评分和分布范围，将rAAV注射小鼠的mm脑切片分为四组。棒材=1000μm。EGFP，增强型绿色荧光蛋白。

图2
**12种rAAV在成年小鼠脊髓中的一般转导特性**.rAAV型*EGFP公司*在4岁时将s注射到10周龄小鼠的尾静脉 × 10¹²每只小鼠的基因组拷贝数（GC）（有关进一步描述，请参见图1，n个= 3). 显示了rAAV注射小鼠的颈脊髓、胸脊髓和腰脊髓切片的合成图像，这些切片基于EGFP半定量评分和分布范围分为四组。棒材=250μm。

图3
**成年小鼠中枢神经系统（CNS）转导细胞类型的量化**不同rAAV转导的神经元和胶质细胞类型的半定量评分*EGFP公司*s.通过显微镜对EGFP阳性CNS细胞类型进行评分(**e（电子）**,小时)rAAV转导的星形胶质细胞(d日,克)神经元，以及(**（f）**,我)少突胶质细胞(b条,d日–**（f）**)大脑和(**c（c）**,克–我)显示脊髓(n个= 3). ***P（P）*< 0.0033, ****P（P）*< 0.001, *****P（P）*<0.0001。ns，无显著性。

图4
**rAAVrh.8对不同神经元群体的转导谱**将.rAAVrh.8载体注射到10周龄小鼠的尾静脉中 × 10¹²每个小鼠的基因组拷贝数。EGFP染色如图1图例所示。图中显示了中枢神经系统（CNS）细胞转导的高倍图像汇编，以及它们在bregma-2.00低倍视图中的相应位置毫米(**a–i**)以及其他与临床相关的脑区(即所选脑切片的低倍放大视图中未显示的嗅球（OB）、黑质（SN）、外侧隔核（LSN）和小脑。CC，胼胝体；海马CA2、CA2区；DG，齿状回；PC，梨状皮质。条形图英寸**a、 c、h**=10µm。条形图英寸**d、 f，i**=15µm，棒材**b、 e，克**=20µm（对于棒材，请参见**补充图S3**).

图5
识别接受静脉注射rAAVrh.8的成年小鼠中转导的中枢神经系统（CNS）细胞类型*EGFP公司*切片用抗EGFP、NeuN（神经元）、GFAP（星形胶质细胞）、APC（少突胶质细胞）、Iba1（小胶质细胞）、CD31（血管）的抗体染色。目标×60。棒材=20µm。APC，大肠腺瘤性息肉病；胶质纤维酸性蛋白。

图6
**小鼠体内的生物分布情况**. (一)rAAV的生物分布概况*EGFP公司*静脉注射后成年小鼠的s。持久rAAVEGFP公司通过定量聚合酶链反应，使用靶向载体基因组多聚A区的引物/探针集，对rAAV治疗小鼠8种不同组织中的载体基因组进行量化(n个= 3). (b条). 大脑中检测到的载体基因组与肝、心、肺和胰腺组织中检测到载体基因组的比率(n个= 3). *****P（P）*<0.0001。ns，无显著性。

图7
静脉注射rAAVrh.10的成年绒猴脊髓和中脑中强大的EGFP转导*EGFP公司*对一只4岁的雄性绒猴进行了rAAVrh.10CB静脉注射*EGFP公司*剂量为5 × 10e13 GCs/kg，2周后尸检。如方法和图1图例所述，分离、固定、切片并染色中枢神经系统（CNS）组织以检测EGFP。所有切片均用苏木精复染。(**a、 c、e**)颈、胸和腰椎脊髓的低分辨率图像。(**b、 d、f**)框状区域的高度放大显示转导运动神经元**a、 c和e**分别为。(**g、小时**)腹侧中脑的低分辨率图像。(我)盒子区域的高放大率克和小时在动眼神经核（3N）中显示转导良好的运动神经元。条形图英寸**a、 c、e、g、h**=200微米。条形图英寸**b、 d、f、i**=100微米。

图8
**静脉注射或鞘内注射rAAVrh.10处理的成年绒猴外周组织的EGFP转导*EGFP公司*或*EGFP3XMRBS系统*矢量**.雄性成年绒猴静脉注射rAAVrh.10CBEGFP公司或rAAVrh.10CBEGFP-（miR-1BS）^三*-（miR-122BS）*^三剂量为5 × 10e13 GCs/kg或i.t.注入rAAVrh.10CBEGFP公司剂量为2.7 × 10e12 GCs/kg。用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚荧光对8微米外周组织切片进行反染，并在显微镜下评估EGFP的天然表达。给出了肝脏天然EGFP表达的荧光图像（概述×100，插图×400目标）(**a、 c、e**)和肾上腺(**b、 d、f**)成年雄性绒猴的组织接受rAAVrh.10EGFP公司由(**a、 b条**)静脉注射或(**e、（f）**)i.t.注射或rAAVrh.10EGFP3XmiRBS系统由(**c、 d日**)静脉注射。条形图英寸**a–i**=50微米。钢筋嵌入10μm。

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