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.2014年7月；357(1):253-66.
doi:10.1007/s00441-014-1823-y。 Epub 2014年4月26日。

趋化因子CXCL12及其受体CXCR4和CXCR7在人MCF-7乳腺癌细胞中的联合内化作用

克里斯汀·哈特曼 1, 埃里克·霍尔岑伯格, 弗里德里克·汉斯, 拉尔夫·卢修斯, Janka Held-Feindt公司, 罗尔夫·门特林
附属公司

趋化因子CXCL12及其受体CXCR4和CXCR7在人MCF-7乳腺癌细胞中的联合内化作用

克里斯汀·哈特曼等。 细胞组织研究. 2014年7月.

摘要

趋化因子CXCL12（基质细胞衍生因子-1，SDF-1）及其受体CXCR4在肿瘤的发生、促进、进展和转移中发挥着重要作用，尤其是对乳腺癌细胞。最近，CXCR7被确定为CXCL12的第二受体；然而，它也结合CXCL11（干扰素诱导的T细胞α趋化因子，I-TAC）。然而，对这两种受体的共同表达及其相互作用知之甚少。定量逆转录加聚合酶链反应表明，这两种受体经常在乳腺癌细胞系中共同表达，而其他肿瘤细胞系通常只表达其中一种。对于相互作用研究，我们选择了MCF-7乳腺癌细胞，因为它们在蛋白质水平上高度表达CXCR4和CXCR7，但不表达CXCR3（CXCL11的另一个靶点）。免疫荧光和光镜和电镜金标显示，这两种受体均位于非刺激细胞的细胞表面。在暴露于CXCL12或CXCL11后，受体被单独或紧密地快速内化。用CXCR4-或CXCR7-选择性非肽类拮抗剂AMD3100和CCX733刺激不仅导致单一内化，还部分导致两个受体的共同内化。此外，这两种趋化因子配体均能减少staurosporine诱导的细胞凋亡和caspase-3/7活化；然而，选择性抑制剂对这些生物反应仅具有部分抑制作用。我们的发现表明CXCR4和CXCR7在乳腺癌细胞中密切相互作用。两者共同内化，传递信号并诱导进一步的生物效应，部分独立于选择性刺激或拮抗剂。

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图1
图1
趋化因子受体在MCF-7和其他各种来源的肿瘤细胞中的表达。一通过定量逆转录加聚合酶链反应（RT-PCR）测定不同类型肿瘤细胞中趋化因子受体CXCR4和CXCR7的转录。∆给出了与3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）相关的CT值(n个 = 三 ± S.D.）；∆计算机断层扫描 = 3.33相当于一个震级。乳腺癌细胞株显示不同水平的CXCR4和CXCR7转录；大多数情况下，这两种受体是共表达的。与乳腺癌细胞相比，胶质瘤细胞(U343型)表现出CXCR7的优先表达（更多数据见Hattermann等人2010），而小细胞肺癌细胞(OH1型,OH2型,SW2型)和神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y型)只转录CXCR4。在黑色素瘤细胞系中，这两种受体要么都无法检测到(液氧)或单独转录（in梅尔·朱索，仅CXCR4；在里面梅尔6，仅CXCR7）。b条定量RT-PCR（qRT-PCR；参见一). CXCR4和CXCR7都被转录，但不是CXCR3（但引物/探针产生T细胞作为阳性对照的信号，未显示）。此外，CXCR4/7配体CXCL12的表达水平较低，而CXCR3/7配体CX3CL11刚好高于检测限。c（c）不同类型人类肿瘤细胞膜组分中趋化因子受体CXCR4和CXCR7的Western blot清楚地揭示了MCF-7乳腺癌细胞中CXCR4与CXCR7双重产生，在U343胶质瘤细胞中单一表达CXCR7，在LOX黑色素瘤细胞中两种受体均不存在，如qRT-PCR所示（caveolin-1：负载控制）
图2
图2
免疫荧光显微镜观察到，在各种配体刺激下，趋化因子受体CXCR4和CXCR7内化为MCF-7细胞。一趋化因子受体在4°C下用红色（CXCR4）和绿色（CXCR7）休眠细胞中的荧光（次级）抗体。在没有刺激的情况下，受体单独分散或靠近细胞表面。b条对于二级抗体对照，省略了一级抗体。c-h公司在37°C的不同时间用不同配体刺激可诱导内化。暴露于趋化因子CXCL12（10 nM；c（c）,e（电子）)或CXCL11（10 nM；d日,（f）)或非肽类受体选择性拮抗剂AMD3100（1μM；克)或CCX733（0.1μM；小时)受体大部分或部分迅速内化在一起（另请参阅插入)
图3
图3
CXCR4和CXCR7定位测量。a-f型趋化因子受体是免疫染色的，在37°C下刺激可诱导其内化（参见图2）。膜用Alexa-Fluro-647标记的小麦胚芽凝集素（WGA）染色青色).克根据膜信号，测量CXCR4和CXCR7信号的强度，得出细胞溶质：表面比率（平均值 ± SD）。非刺激细胞产生的比率低（大多数受体位于表面），而趋化因子和合成拮抗剂产生的比率高（大多数受体在细胞内发现）。对于每个刺激，从两个独立的实验中分析了至少10个细胞（定量方法如补充图1所示）
图4
图4
通过免疫金电子显微镜观察各种配体刺激MCF-7细胞中趋化因子受体CXCR4和CXCR7的内化。在4°C下，CXCR4由15-nm金颗粒免疫标记，CXCR7由较小的5-nm金颗粒标记。在37°C的不同时间用不同配体刺激后进行内化，如图2所示(箭头金颗粒）。a–d在休眠细胞上，这两种标记大多单独出现在细胞表面上，以单个点的形式出现，但有时也以大小点簇的形式出现。e–l型在配体诱导的刺激下，受体被内化并在细胞内小泡中发现。在这里，它们经常以一个或混合大小的点为组进行累积。在CXCL11作为CXCR7选择性配体的情况下观察到这种共内化(电子-小时)或CXCL12作为这两种受体的配体(i-l公司). 为了提高金颗粒的可视性，切片仅轻微暴露于四氧化锇和柠檬酸铅
图5
图5
在缺乏和存在CXCR4-和CXCR7-特异性拮抗剂的情况下，经CXCL12刺激后，MCF-7细胞中细胞外信号调节激酶Erk1/2（p42/p44）的磷酸化(pErk公司磷酸化Erk，Ctrl键仅用拮抗剂控制）。一,b条用配体（1或10 nM）、拮抗剂（AMD3100，10μM；CCX733，0.1μM）、组合或阳性对照物（10 ng/ml表皮生长因子，表皮生长因子)用磷酸化激酶和GAPDH抗体（或Erk2的再蛋白，未显示）进行蛋白质印迹分析，以确保相等的负载。几个独立刺激的示例(顶部)和手段 ± 密度测定标准偏差n个 = 5个实验(底部). 在无血清培养基和0.1%牛血清白蛋白中对清洗后的和1-h预平衡的细胞进行刺激。在实验前1小时，从二甲基亚砜（DMSO，0.1%最终浓度）的储备溶液中添加抑制剂；在所有其他培养基中添加了相应数量的二甲基亚砜
图6
图6
CXCL11和CXCL12抑制staurosporine诱导的MCF-7细胞凋亡和caspase-3/7激活，以及选择性CXCR4和CXCR7抑制剂的影响。100 nM staurosporine在DMEM中诱导细胞凋亡 + 0.2%FCS，24小时后通过定量凋亡细胞核或8小时后通过测量caspase-3/7活性进行分析。一,b条正常细胞核的可视化(一)和有凋亡迹象的细胞核(b条,箭头细胞核因碎裂和/或染色质凝聚而受损）。c（c）两种趋化因子配体，即5 nM CXCL11和1 nM CXCL12，均显著降低了staurosporine诱导的细胞凋亡。d日这种抗凋亡作用可以通过与CXCR7选择性拮抗剂CCX733（0.1μM）共同孵育而逆转，但CXCR4选择性拮抗剂AMD3100（5μM）则不显著。这两种拮抗剂本身没有抑制作用（未显示）。几个检查区域的三份计数方法n个 = 4 ± 由公正的人进行SD个人刺激。e（电子）证实形态学结果的是，两种趋化因子配体，即5nM CXCL11和1nM CXCL12，显著降低了星形孢菌素诱导的胱天蛋白酶3/7的激活。同样，拮抗剂CCX733（0.1μM）而非AMD3100（5μM）降低了这种抗凋亡作用。重复测量的方法n个 = 三 ± SD个人刺激(*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001). 拮抗剂对基础或staurosporine诱导的辣椒酶活性均无影响。从DMSO中的储备溶液中添加Staurosporine和拮抗剂，最终浓度为0.5%；因此，在所有其他培养基中添加了相应数量的二甲基亚砜
图7
图7
选择性激动剂或拮抗剂刺激后CXCR4和CXCR7在人乳腺癌细胞中的表达
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