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.2014年6月6日；289(23):16016-31.
doi:10.1074/jbc。M114.552216。 Epub 2014年4月24日。

成骨细胞中的RUNX2池蛋白：特征、分化后的下调以及与基因表达的关系

马克·梅耶 1, 南希·本库斯基 1, J韦斯利·派克 2
附属公司

成骨细胞中的RUNX2池蛋白：特征、分化后的下调以及与基因表达的关系

马克·梅耶等。 生物化学杂志. .

摘要

RUNX2是一种转录因子，最早在早期成骨细胞系细胞中表达，是成骨细胞生成的主要决定因素。虽然RUNX2调节了许多靶基因，但对RUNX2s占据的基因组上的位点或受这些位点控制的基因网络知之甚少。为了探索这一点，我们对成骨前MC3T3-E1细胞（POB）及其成熟成骨后代（OB）中的RUNX2顺反子体进行了全基因组分析，对这两个顺反子体征进行了表征，并评估了它们与基因表达变化的关系。我们发现，尽管RUNX2与POB细胞的基因组广泛结合，但在分化为OBs后，这种结合谱降低；许多位点对这两种细胞状态来说仍然是共同的。还确定了其他特征，包括相对于潜在靶基因的位置、相对于单个基因的丰度、常见的TGTGGT RUNX2结合基序、C/EBPβ共现以及典型的表观遗传组蛋白增强子特征。这种特征在分化后发生了定量变化。虽然RUNX2结合位点与邻近基因广泛相关，但大多数位点的远端性质阻止了评估它们是否代表RUNX2-作用的直接靶点。然而，基因表达的变化揭示了含有RUNX2结合位点的基因的丰富性，并且这些基因受到一致的调控。这些研究为进一步分析RUNX2活性的作用及其在成骨细胞系成熟过程中的功能奠定了基础。

关键词：CCAAT增强子结合蛋白（C/EBP）；细胞分化；ChIP-seq；染色质组蛋白修饰；染色质免疫沉淀（ChiP）；西斯特罗姆；成骨细胞；RUNX2系列。

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数字

图1。
图1。
MC3T3-E1电池(POB（港口）)向分泌基质的成骨细胞分化(产科医生). A类，细胞分化至第15天(产科医生)直到第30天。冯·科萨(VK公司)，茜素红(AR公司)和碱性磷酸酶(碱性磷酸酶)进行染色。B类此外，还进行了酶活性测定，以评估碱性磷酸酶在分化过程中的活性。碱性磷酸酶活性显示为每升（L）的国际单位（IU），已归一化为总裂解蛋白。实验以一式三份±S.E.的形式完成，是两个实验的代表。*，第页与D0（POB）相比，<0.05 D15（OB）或D30。
图2。
图2。
成骨细胞系中RUNX2池的分析。 A类，文氏图描述了使用HOMER评估的未分化的重复标准化RUNX2结合位点(POB（港口）)和在体外差异化的(产科医生)MC3T3-E1电池。箭头使用GREAT将RUNX2结合位点子集（POB特异性、OB特异性和POB/OB重叠）链接到注释的相邻基因。B类，RUNX2 ChIP-seq标签密度的统计富集。峰分为POB>2倍（POB>，黄色的)，相等（无统计差异，相等/ns）且OB>2倍（OB>，蓝色)然后使用GREAT最近邻分析与基因相关。重叠区域显示为绿色。C类，三份POB和OB细胞核提取物RUNX2水平的Western blot。密度计显示归一化为LaminB水平±S.E.POB的波段强度与OB不显著。天对POB和OB的RUNX2站点进行了伟大的分析，分析结果表明，该站点与TSS的距离是以千基（kb）为单位的。E类,从头开始HOMER对POB和OBs中RUNX2峰的序列过度表示分析。丰度以百分比表示(黑色)与50000个GC内容匹配序列相比(红色).F类，排名前4的基因本体(GO（开始）)分子功能的术语(MF公司)，生物过程(英国石油公司)，或蜂窝组件(科科斯群岛)对于表顶部列出的RUNX2峰值的每个峰值类别。G公司，ChIP-seq标记密度追踪在RUNX2 ChIP-seq结合（POB，黄色的; 产科，蓝色; 重叠，绿色). 显示基因组位置和规模，Y轴上显示数据轨道标签序列密度的最大高度（归一化为输入和107标签）。基因转录方向由箭头外显子盒。H（H），通过ChIP qPCR进行ChIP-seq峰值验证。ChIP值显示为标准化输入（数量/输入）。RUNX2（运行2）(黑色条)与非特异性IgG比较(灰色条). *,第页与IgG相比，RUNX2<0.05。在每个引物组中，还将POB与OB进行比较。#，第页<0.05 RUNX2 POB与RUNX2 OB相比。底漆用于Spp1型和第18层基因组位点。距离与每个基因的TSS有关。每个实验重复三次±S.E.，代表三个实验。
图3。
图3。
C/EBPβ与RUNX2的相关性。 A类，使用HOMER评估POB和OBs中重复标准化C/EBPβ结合位点的文氏图描述。箭头使用GREAT将C/EBPβ结合位点亚群（POB特异性、OB特异性和POB/OB重叠）与注释的相邻基因联系起来。B类，POB和OB的C/EBPβ位点与TSS距离的函数关系分析（千碱（kb））。C中，从头开始HOMER对POB和OBs中C/EBPβ峰的序列过表达分析。丰度以百分比表示(黑色)与50000个GC内容匹配序列相比(红色).天，POB和OB的RUNX2和C/EBPβ峰的维恩图重叠。E类，所有RUNX2峰的ChIP-seq标记密度（每个峰每bp的ChIP-碎片深度）(左边)以及所有C/EBPβ峰(正确的). POB的RUNX2峰值(黄色的)和OB(深黄色)，POB的C/EBPβ峰(绿色)和OB(深绿色).F类排名前4的基因本体(GO（开始）)分子功能的术语(MF公司)，生物过程(英国石油公司)，或蜂窝组件(科科斯群岛)RUNX2和C/EBPβ重叠的区域。G公司，RUNX2和C/EBPβ（POB，黄色的; 产科，蓝色; 重叠，绿色）。更多细节如图2所示。
图4。
图4。
染色质景观由RUNX2位点附近的组蛋白修饰预测。 A类，平均ChIP-seq标签配置文件(年轴是标记密度），通过CEAS分析显示H4K5Ac、H3K9Ac、H3K 4me1、H3k 4me3和H3K 36me3相对于mm9基因组的平均基因（所有UCSC已知基因）。剖面显示为TSS上游-1kb和基因下游+1kb语音合成（转录终止位点）。B类ChIP-seq标记密度集中于POB重叠的RUNX2和C/EBPβ峰以及与组蛋白标记物的相互作用。C类RUNX2、C/EBPβ、H4K5Ac、H3K9Ac、H3K 4me1、H3k 4me3和H3K 36me3（POB，黄色的; 产科，蓝色; 重叠，绿色)在免疫球蛋白5和隧道1基因位点。更多细节如图2所示。
图5。
图5。
RUNX2与POB和OBs中基因表达谱的相关性。 A类，heatmap显示上调（417）或下调（304）的基因，调控幅度大于2倍（95%置信度，中度t吨测试）。数据显示为log2强度；刻度显示在底部，其中红色代表高和蓝色低表达。B类RUNX2 GREAT相关基因（6856、4367和2063）与上调和下调基因相互参照（60个上调和32个下调基因与所有三个峰值状态相同）。C类，将GREAT相关基因与POB和OBs中基因表达的前20%（4487个基因）和后20%（3483个基因）五分位数（删除了重叠的登录号）进行比较。天，每个类别的基因本体来自B类显示了对这些类别的类似丰富。E类POB中H4K5Ac平均基因谱的CEAS比较(实线)和OB(虚线). 上调基因如所示红色; 下调基因显示在蓝色; 所有基因都显示在黑色。F类RUNX2、C/EBPβ、H4K5Ac、H3K9Ac、H3K 4me1、H3k 4me3和H3K 36me3（POB，黄色的; 产科，蓝色; 重叠，绿色). 更多细节如图2所示。
图6。
图6。
RT-qPCR-Taqman基因表达芯片验证。对分化0、15或30天的细胞进行RT-qPCR。数据在三份分析±S.E.中完成，是三个实验的代表。数据显示为相对定量(RQ（请求）)归一化为β-肌动蛋白（ΔΔCT型)和CT型D0样本的值显示在每个图形上。*，第页与D0相比，小于0.05 D15或D30。
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