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.2014年5月30日；289(22):15798-809.
doi:10.1074/jbc。M113.544346。 Epub 2014年4月23日。

Kruppel-like因子14作为参与信号脂质生成的转录激活物的新作用

Thiago M de Assuncao公司 1, 格温·隆伯格 2, 盛曹 1, 乌斯曼·雅库布 1, 安吉拉·马西森 1, 道格拉斯·西蒙内托 1, 罗伯特·C·休伯特 1, 劳尔·A·乌鲁西亚 三, 维杰伊·沙阿 4
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Kruppel-like因子14作为参与信号脂质生成的转录激活物的新作用

Thiago M de Assuncao公司等。 生物化学杂志. .

摘要

鞘氨醇激酶1（SK1）是一种FGF诱导的基因，负责生成鞘氨醇-1-磷酸，这是一种与多种内皮细胞功能相关的关键脂质信号分子。在本研究中，我们将SK1确定为内皮细胞中典型FGF2/FGF受体1激活途径的靶点，并试图确定介导脂质信号的新转录途径。使用1.9-kb SK1启动子和缺失突变体进行的研究表明，基础和FGF2刺激的启动子活性通过位于转录起始位点633bp内的两个GC丰富区域发生。筛选可激活该位点的富含GC的结合转录因子表明，与肥胖和代谢综合征相关的基因KLF14与该区域结合。同样，KLF14的过表达使基础和FGF2刺激的SK1启动子活性增加了3倍，并且这种作用在富含GC的位点突变后被消除。此外，KLF14 siRNA转染使SK1 mRNA和蛋白质水平降低了3倍。同样，KLF14基因敲除小鼠肝脏中SK1 mRNA和蛋白水平降低。结合荧光素酶、凝胶位移和染色质免疫沉淀试验表明，KLF14与p300偶联，以增加与转录激活相关的组蛋白标记水平（H4K8ac和H3K14ac），同时减少抑制标记（H3K9me3和H3K27me3）。总之，这些结果证明了一种新的机制，即SK1脂质信号通过KLF14和p300赋予的表观遗传修饰来调节。因此，这是对KLF14作为激活蛋白和新型脂质信号调节器功能的活性和机制的首次描述。

关键词：染色质组蛋白修饰；表观遗传学；成纤维细胞生长因子（FGF）；类克鲁珀因子（KLF）；1-磷酸鞘氨醇（S1P）。

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数字

图1。
图1。
FGF2（25 ng/ml）对库存1mRNA水平、SK1酶活性和S1P生成。 A类FGF2刺激肝内皮细胞4h，定量PCR检测SK1水平。B类，的右侧面板显示了感染LacZ或FGFR1腺病毒并用FGF2刺激或不刺激4小时的HUVEC中SK1的mRNA水平左侧面板用感染FGFR1腺病毒的HUVEC细胞进行FGF2时间反应（0、0.5、1、2、4、6、8、10和12 h）。SK1 mRNA水平显示为折叠变化（FGF2/对照）。A类和B类，所有结果均以任意单位表示为相对于内务管理（GAPDH）基因表达的结果。C类，用抗SPHK1抗体进行蛋白质印迹。在FGF2刺激后2、4、6、8和10小时，从HUVEC中测量SK1蛋白水平。天用FGF2刺激6h后，用S1P-ELISA测定HHSEC中S1P的产生。E类FGF2刺激HUVEC细胞的SK1酶活性。这个上部面板显示了HUVEC细胞样本中6小时FGF2刺激的放射自显影。代表性TLC结果如下所示32P标记为S1P。这个下部面板显示了每个波段的密度测量结果。数据显示为三倍的平均值±S.D.，代表了三个独立实验。*，第页< 0.05.
图2。
图2。
人类5′-区启动子结构库存1基因和启动子活性测定。在所有实验中，用1.0μg SK1构建物和0.5μg FGFR1质粒转染HEK 293细胞。A类，以评估FGF2在人类转录激活中的作用库存1用全启动子（SK1）或pGL3碱性载体（EV）转染HEK 293细胞，并用FGF2（25ng/ml）刺激12小时。将相对荧光素酶值归一化为EV对照。B类，的上部面板说明了人类的基因组结构库存1基因。第一个自动液位计的位置被指定为+1。人5′启动子不同长度的缺失突变体库存1显示在左下面板，设计为1977天,1117天,633天、和390天分别是。这个右下面板显示了相应构造的荧光素酶报告子分析。C类，的左侧面板显示了SK1启动子和位于−516和−528 bp之间的SP1/KLF结合位点的结构。相对荧光素酶活性显示在右侧面板。实心立柱是用FGF2处理的样品，以及开放式立柱是未经处理的样本。对于所有实验，从至少三个单独的实验中计算平均值±S.D.，每个实验一式三份。1977d非刺激构建物的相对荧光素酶活性为1.0。在所有实验中测量总蛋白浓度并用于归一化。*，第页< 0.05.
图3。
图3。
KLF14在FGF2刺激后上调，并增加SK1启动子活性。 A类在HHSEC中，使用定量实时PCR测量FGF2（25 ng/ml）刺激后KLF家族成员mRNA折叠的变化。mRNA的倍数变化计算为FGF2刺激的细胞中的KLF水平与未经FGF2处理的细胞中的KLF水平的比率。KLF1、KLF8、KLF9、KLF11和KLF13未扩增。mRNA水平的折叠变化根据底部在图表中。B类，HEK 293细胞转染633d库存1构建FGFR1质粒，以及对照pcDNA空载体或发现在HUVEC细胞中表达的KLF成员之一。这个上部面板(白色条)显示了633d结构的基础激活与不同KLF成员的过度表达，而下部面板(灰色条)显示了相同的条件，但存在FGF2。转染对照空载体且未经FGF2刺激的633d构建物的相对荧光素酶活性为1.0。对于所有实验，从至少三个单独的实验中计算平均值±S.D.，每个实验一式三份。
图4。
图4。
KLF14对于FGF2模拟库存1. A类，KLF14 siRNA阻断FGF2刺激库存1mRNA水平。左侧面板实时PCR分析SK1 mRNA水平。感染FGFR1腺病毒的HUVEC细胞转染100μ米干扰控制siRNA、KLF4 siRNA或KLF14 siRNA。48小时后，如有指示，用FGF2（25 ng/ml）刺激细胞。右侧面板采用定量PCR和常规PCR分析KLF4和KLF14的敲除效率。B类，用100μ米干扰控制siRNA或KLF14 siRNA用于测量库存1蛋白质水平。C类,库存1从WT和KLF14基因敲除的原代肝内皮细胞中测定mRNA水平(Klf14型−/−)老鼠。天，从WT和KLF14敲除分离的原代肝内皮细胞中测量SK1蛋白水平(Klf14型−/−)老鼠。E类用S1P-ELISA检测WT和KLF14基因敲除的原代肝内皮细胞S1P水平(Klf14型−/−)老鼠。所有实验均一式三份。Ctrl键，控制。*，第页< 0.05.
图5。
图5。
KLF14绑定到库存1发起人。 A类、表位标记的KLF14或标记的空载体转染HEK 293细胞。使用FLAG抗体的ChIP分析表明KLF14与库存1启动子，而空载体转染细胞作为对照。B类，使用KLF14重组蛋白进行EMSA(车道3,5,6,9、和11)或控制GST蛋白(车道2,4,8、和10)带有放射性标记的双链探针，其−516/−528 KLF结合位点完整(1–6车道)或探针在同一KLF结合位点发生突变(7–11车道). KLF14与探针和自由探针之间的特定络合物表示为箭头上左边GST抗体移位重组KLF14-SK1探针复合物(车道6)，表示特异性。*，第页< 0.05.
图6。
图6。
人身上H3K4me3、H4K8ac、H3K14ac、H3K9me3和H3K27me3的ChIP检测库存1HUVEC和HEK 293细胞中的启动子。 A类FGF2刺激HUVEC导致H3K4me3、H4K8ac和H3K14ac增加，H3K9me3和H3K27me3减少库存1与未处理细胞相关的启动子。B类、KLF14 His tag或His tab载体转染HEK 293细胞。进行了ChIP分析，结果显示H3K4me3、H4K8ac和H3K14ac增加，H3K9me3和H3K27me3组蛋白标记减少库存1KLF14转染细胞中的启动子。所有实验均一式三份，样本均归一化为各自的输入值。*，第页< 0.05.
图7。
图7。
FGF2在KLF14敲除细胞中的作用。感染FGFR1腺病毒的HUVEC细胞转染100μ米干扰控制siRNA或KLF14 siRNA。如有指示，用FGF2（25 ng/ml）刺激细胞。对H3K4me3、H4K8ac、H3K14ac、H3K9me3和H3K27me3标记进行了ChIP分析。在对照siRNA细胞中用FGF2刺激HUVEC导致H3K4me3、H4K8ac和H3K14ac增加，H3K9me3和H3K27me3标记减少。在KLF14 siRNA转染细胞中未观察到这些变化。所有实验一式三份进行，并将样品标准化为各自的输入。*，第页< 0.05.
图8。
图8。
组蛋白乙酰转移酶p300在细胞激活中的作用库存1发起人。 A类，ChIP分析显示p300募集到库存1. The左侧面板显示p300结合在库存1FGF2刺激后HUVEC细胞的启动子。这个右侧面板结果表明，在转染KLF14的HEK 293细胞中，p300被招募到SK1.B系列用633d SK1构建物进行荧光素酶分析。如图所示，用633d启动子构建物、KLF14质粒和不同浓度的p300质粒或p300显性阴性（p300 DN）质粒转染HEK 293细胞。外源性p300的存在增加了库存1启动子呈剂量依赖性，而p300 DN的转染消除了这种激活。转染pcDNA空载体的633d构建物的相对荧光素酶活性为1.0。在实验中测量总蛋白浓度并用于归一化。C类在Sin3-HDAC结合位点（KLF14-Sin3）上，KLF14野生型结构体和携带突变的KLF14结构体的过度表达增加了SK1 mRNA水平。不同剂量p300的伴随表达进一步增加了这些水平，而p300 DN的过度表达则抵消了这种影响。天，HEK 293细胞与His tag-KLF14或His tag-EV和p300共转染。使用抗His tag-agrose珠进行免疫沉淀，使用抗p300的Western blot显示KLF14与p300结合。E类，当将携带Sin3-HDAC结合位点突变的KLF14构建物（KLF14-Sin3）与KLF14野生型构建物进行比较时，未观察到SK1启动子活性的变化。所有实验均一式三份。IB公司免疫印迹；IP（IP）免疫沉淀；NS公司，不显著。*，第页< 0.05.
图9。
图9。
SK1基因KLF14转录激活模型。SK1基因的激活和S1P的产生是由于FGF2与FGFR1受体结合导致KLF14上调SK1启动子。在我们的模型中，FGFR1的激活导致KLF14通过其富含GC的位点与SK1启动子结合。然后，通过增加H4K8ac、H3K14ac和H3K4me3标记以及减少H3K9me3和H3K27me3标记，招募p300并促进染色质从转录“非活性”状态到“活性”状态的重塑。
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