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.2014年6月；42(10):6365-79.
doi:10.1093/nar/gku296。 Epub 2014年4月20日。

NuMA通过调节DNA断裂处ISWI-ATPase SNF2h的积累促进同源重组修复

皮尔雷·阿莱克安德烈·维迪 1, 刘静（音译） 2, 丹妮拉·萨尔斯 三, 斯瓦提·贾亚拉曼 4, 乔治·多夫曼 5, 马修·格雷 4, 帕特里夏·阿巴德 4, 普拉巴斯五世·莫赫 5, 约瑟夫·伊鲁达亚拉吉（Joseph M Irudayaraj） 6, 丽莎·维斯米勒 三, 苏菲·A·莱利维尔 7
附属公司

NuMA通过调节DNA断裂处ISWI-ATPase SNF2h的积累促进同源重组修复

皮尔雷·阿莱克安德烈·维迪等。 核酸研究. 2014年6月.

摘要

染色质重塑因子通过塑造染色质促进修复过程，在DNA损伤反应中发挥积极作用。这些因素的时空调控是其功能的关键，但人们对其了解甚少。我们报道，结构核蛋白NuMA以聚[ADP核糖]酰化依赖的方式在DNA损伤位点积累，并与ISWI ATP酶SNF2h/SMARCA5（一种促进DNA修复的染色质重塑剂）在功能上相互作用。NuMA与SNF2h共免疫沉淀，调节其在核质中的扩散，并控制其在DNA断裂时的积累。与支持SNF2h功能的NuMA相一致，具有沉默NuMA的细胞在DNA切割后表现出染色质失活减少，同源重组修复因子的局部募集减少，染色体（但不在胞体）环境中受损的DNA双链断裂修复，以及对DNA交联剂的敏感性增加。这些发现揭示了染色质重构的结构基础，即支架蛋白通过将重塑剂导向DNA断裂来促进基因组维持。

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数字

图1。
图1。
NuMA与SNF2h相互作用(一)SNF2h-GFP和mCherry-NuMA在非肿瘤HMT-3522 S1细胞中瞬时共存的共聚焦图像。用DAPI对细胞核进行复染。(b条)通过免疫染色分析S1细胞中NuMA和SNF2h的克隆化。箭头表示共聚焦。(c（c）)来自S1核提取物的NuMA和SNF2h的IP。非特异性免疫球蛋白（IgG）用作对照。western blot检测NuMA、SNF2h和WSTF。(d日)从HMT-3522 T4-2恶性细胞核提取物中提取的NuMA IP，模拟照射或暴露于3 Gyγ射线下，然后静置30分钟恢复。IP样品中的SNF2h信号强度通过密度测定法进行量化，并取平均值(n个=4，仪表板底部）。通过探测输入样本中的γH2AX来验证DNA损伤诱导；H2B被用作负荷控制。(e（电子）)使用荧光寿命成像在未辐照（对照）和辐照（10Gy）U2OS细胞中测量FRET。SNF2h用与Alexa Fluor偶联的抗体染色®488（FRET供体）和NuMA与Alexa Fluor®555结合抗体（FRET受体）。在无受体或有受体的情况下测量供体荧光寿命，并用于计算FRET效率。给出了供体的代表性荧光寿命图像。条形图表示平均值±SEM FRET效率(n个=3个实验；≥每个实验中25个细胞/条件）。(（f）)荧光相关光谱法测量GFP标记SNF2h在U2OS细胞中的扩散。SNF2h片段（C-末端a.a.644-1053和N-末端a.a.1-643）和GFP单独用作对照。将转染NuMA靶向siRNA（siNuMA）的细胞与转染非靶向siRNAs（siNonTarget）的细胞进行比较。图中显示了典型的共焦图像（左）和FCS曲线（中）。扩散时间在图表中表示为平均值±SEM(n个来自至少两个生物复制品的≥20个细胞）。(克)免疫染色证实NuMA沉默。比例尺，10μm。
图2。
图2。
DNA断裂时SNF2h的积累需要NuMA。(一)转染NuMA siRNA和非靶向siRNA的U2OS细胞中SNF2h-GFP、GFP-53BP1和GFP-PCNA在激光微辐照条带（箭头）处的积累。辐照条带处的平均归一化像素强度如底部面板所示(n个≥10个细胞*P（P）<0.05，未配对t检验）。(b条)通过western blot定量内源性和重组SNF2h在SNF2h-GFP或GFP U2OS细胞中的表达。Ponceau染色显示载荷相等。(c（c）)S1细胞SNF2h和γH2AX免疫染色。对细胞进行微辐射并使其恢复30分钟。siRNA转染细胞中重叠SNF2h和γH2AX条带的细胞核百分比在条形图中表示为平均值±SEM(n个=3个生物复制，每个实验中>50个细胞/条件）。比例尺，10μm。
图3。
图3。
NuMA在DNA损伤位点积累。(一)激光微照射30 min后S1细胞中NuMA和53BP1（用作DNA损伤标记物）的免疫染色。NuMA信号强度通过热图可视化。(b条)微辐射前后细胞的亮场图像（红色箭头）。(c（c）)通过免疫染色在微辐射细胞中检测乙酰化组蛋白4（H4K12ac）、层粘连蛋白B和γH2AX，如A(d日)激光微辐照后的NuMA检测就地提取可溶性和染色质结合蛋白。弱DAPI染色证实DNA释放。(e（电子）)激光微照射后的双重NuMA-γH2AX免疫染色。用载体或ATM抑制剂KU55933处理细胞（ATM，10μM，2 h）。在使用γH2AX信号确定的辐照区域测量NuMA染色强度。在未经辐照的细胞中，绘制模拟条纹作为γH2AX的替代物。微辐照和模拟条纹的像素强度归一化为细胞核中的平均强度（左图；n个≥80个细胞/条件*P（P）<0.001，方差分析和Tukey多重比较试验）。图中还显示了带有NuMA条纹的细胞的相对比例（右图；n个=4个生物复制品）。(（f）)对用PARP抑制剂IQD（PARPi，30μM，2 h）处理或用非靶向siRNA或PARP3 siRNA转染的细胞进行（e）分析(n个≥3个生物复制品*P（P）<0.05，一个样本t检验）。通过western blot验证H处理S1细胞对PARP的抑制作用2O（运行）2（10 mM，10 min）。Ponceau染色显示为负载控制。(克)在转染PARP3 siRNA和非靶向siRNA的U2OS细胞中，SNF2h-GFP在激光微辐照条带处的积累。辐照条带的平均归一化像素强度如图所示(n个≥15个细胞*P（P）<0.05，非配对t检验）。比例尺，10μm。
图4。
图4。
NuMA是有效修复DSB所必需的。(一)典型NHEJ在I-SceI诱导MCF-7细胞中的DSB后与包含巨核酶识别位点的修复底物的基因组整合。用NuMA或非靶向（shControl）特异性shRNA构建物转染细胞，并用基因组PCR定量末端连接I-SceI位点的重建。如有指示，用IQD处理细胞（PARPi，200μM，48 h；n个= 3; *P（P）<0.05，一个样本t检验）。(b-d（英国）)利用HR-GFP报告子的稳定基因组整合在MCF-7细胞中测量HR修复。通过流式细胞术定量GFP阳性事件的频率(n个=3–5个实验，三次测量，每次通过单个转染效率进行校正；*P（P）<0.05，方差分析和Tukey多重比较试验）。(b条)细胞转染NuMA siRNA或非靶向siRNA，转染显性阴性形式RAD51（SMRAD51）的cDNA，以及I-SceI以诱导DSB。(c（c）)如图所示，用NuMA和/或SNF2h siRNA转染细胞。使用DNA-PK作为负载控制（插图），通过western blot验证NuMA和SNF2h沉默。(d日)用shRNA质粒转染细胞，并用KU55933（ATMi，10μM，48 h）处理，如图所示。(e（电子）)K562细胞中同源依赖性DNA修复与长同源性HR-GFP报告子的稳定整合左心室; 顶部）或具有短同源性（HR-GFP上海; 底部）。如图所示，用SMRAD51和shRNA转染细胞。HR-GFP中的RAD51依赖HR部分修复了I-Sce介导的解理左心室细胞，但不在HR-GFP中上海如SMRAD51灵敏度所示。(（f）)Western印迹显示在如E中处理的细胞中SMRAD51的表达和NuMA的缺失；微管蛋白作为负荷控制。(克)HR-GFP质粒瞬时转染后MCF-7细胞上体DNA的HR修复。
图5。
图5。
NuMA调节DNA断裂时HR因子的招募。(一)转染NuMA siRNA或非靶向siRNA的U2OS细胞中GFP-CtIP和RFP-PCNA在激光微辐照条带处的积累。辐照条带的平均归一化像素强度如右图所示(n个=20个单元*P（P）<0.05，未配对t检验）。(b条)在I-SceI裂解位点形成BRCA1和RAD51病灶。携带由LacO重复序列侧翼的I-SceI识别位点稳定基因组整合的U2OS细胞被I-Sce1（+I-SceI）转染以诱导DSB、LacR-GFP可视化DSB位置和siRNA，如图所示。在未分离的对照中，I-SceI cDNA被省略。定量了LacR-GFP和RAD51或BRCA1免疫染色信号之间的重叠，并显示在条形图中(n个=4个生物复制品*P（P）<0.05，与siNonTarget相比，未配对t检验）。(c（c）)在细胞周期蛋白B1染色的指导下，对B中的RAD51病灶进行量化(n个= 3; *P（P）<0.005，未配对t检验）。用细胞质周期蛋白B1信号（箭头）区分U2OS细胞中HR竞争性晚期S/G2期和G1/早期S期群体。在同一荧光通道中，RAD51染色（核信号）标记DNA修复病灶。在博莱霉素（BLM）处理的细胞和裂解的I-SceI阵列（LacR-GFP病灶；箭头）中，仅在细胞周期蛋白B1阳性细胞中观察到RAD51病灶的形成。(d日)转染NuMA特异性、SNF2h特异性或非靶向siRNA的S1细胞中BRCA1病灶的免疫染色。照射细胞（IR，3 Gy）并使其恢复3 h。显示合并BRCA1（红色）、细胞周期蛋白B1（绿色）和DAPI（蓝色）信号的共聚焦图像。(e（电子）)用细胞周期蛋白B1信号处理细胞中BRCA1病灶的定量来选择HR竞争性细胞。结果代表平均值±SEM(n个= 3, *P（P）<0.05，ANOVA和Tukey的事后检验，与siNonTarget相比）。(（f）)在与D中一样处理的S1细胞中形成RAD51病灶(n个= 3; *P（P）<0.05，与siNonTarget相关的一个样本t检验）。(克)共焦图像和(小时)用FK2抗体在D处理的细胞中检测到的结合泛素（-Ub）病灶的定量(n个= 3, *P（P）<0.05，方差分析和Tukey's）。比例尺，10μm。
图6。
图6。
NuMA在接触MMC的细胞中调节DNA修复和细胞存活。(a-b公司)经MMC（18 h，2.6μM）或载体处理的U2OS细胞中BRCA1、RAD51和γH2AX修复灶的形成。所示为典型共焦图像（a）和转染NuMA和非靶向si或shRNA的细胞中的病灶定量（b）(n个= 3, *P（P）<0.05，未配对t检验）。(c（c）)用台盼蓝染色法测定按（b）处理的细胞的细胞活力(n个= 2). 比例尺，10μm。
图7。
图7。
γH2AX焦点的维护需要NuMA。(a–b)转染NuMA特异性或非靶向siRNA的S1细胞中γH2AX的积累。在γH2AX和NuMA免疫染色之前，照射细胞（3 Gy）并使其恢复30 min、2 h和6 h。(一)典型共焦图像。(b条)病灶密度量化。使用NuMA siRNA处理的保留NuMA表达的细胞被排除在分析之外。非靶siRNA转染的标准值如插图所示(n个= 4; *P（P）<0.05，单样本t检验）。(c（c）)使用抗γH2AX、NuMA抗体（评估沉默）以及作为A-B处理的S1细胞的层粘连B和H2B（负荷对照）进行Western blot分析。(d日)共焦图像和(e（电子）)（a–b）中处理的S1细胞中53BP1病灶形成的定量(n个= 4). 比例尺，10μm。
图8。
图8。
使NuMA沉默的细胞对DNA损伤的染色质反应发生改变。(一)从模拟辐照（对照）或辐照（3 Gy）细胞DAPI染色细胞核的共焦图像中提取纹理描述符。利用主成分分析将描述子压缩到三维复合特征空间。图上的每个点代表一个原子核。数据来自四个生物复制品。高特异性、敏感性和准确性值表明两个细胞群分离。(b条)DAPI纹理分析与转染NuMA siRNA或非靶向siRNA的细胞中的A一样进行。照射后的细胞保留30分钟或2小时恢复(c（c）)测量用NuMA siRNA或非靶向siRNA处理的U2OS细胞中的裂解（+I-SceI）和未裂解LacO阵列大小。图像显示用LacR-CFP和γH2AX标记的LacO数组（用于验证是否存在裂解）。图中的值表示平均值±SEM(n个来自三个实验的约50个细胞*P（P）<0.05，方差分析和Tukey多重比较试验）。比例尺，50μm（b）和1μm（c）。
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