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.2014年8月；62(8):1227-40.
doi:10.1002/glia.22675。 Epub 2014年4月15日。

星形细胞转化生长因子-β信号转导减少小鼠卒中后的亚急性神经炎

白鹭Cekanaviciute 1, 南希·法塔利, 克里斯蒂安·多伊尔, 亚伦·M·威廉姆斯, 朱莉·韩, 马里恩·巴克沃尔特
附属公司

星形细胞转化生长因子-β信号转导减少小鼠卒中后的亚急性神经炎

白鹭Cekanaviciute等。 格利亚. 2014年8月.

摘要

星形胶质细胞限制CNS损伤后的炎症反应，至少部分是通过将其物理性地包含在损伤边缘的星形胶质细胞瘢痕中。我们在此报道，星形胶质细胞转化生长因子-β（TGFβ）信号传导是星形胶质细胞用来限制神经炎症的第二种独特机制。TGFβ是一种抗炎和神经保护性细胞因子，在中风后的一个临床可达到的时间窗内亚急性上调。我们之前已经证明，TGFβs在卒中后几天向卒中边缘的星形胶质细胞、神经元和小胶质细胞发出信号。为了研究TGFβ是否影响星形胶质细胞免疫调节功能，我们设计了“Ast-Tbr2DN”小鼠，其中TGFβ信号在星形胶质细胞中被特异性抑制。尽管Ast-Tbr2DN小鼠的梗死面积与野生型对照组相似，但在远端中脑梗塞（dMCAO）卒中后的亚急性期，其表现出明显更多的神经炎症。与对照组相比，Ast-Tbr2DN小鼠的近端皮层含有60%以上活化CD11b（+）单核细胞，活化小胶质细胞和巨噬细胞标记物CD68的免疫染色是对照组的两倍。Ast-Tbr2DN小鼠的星形细胞瘢痕没有改变。然而，在dMCAO后2天，Ast-Tbr2DN小鼠不能上调TGF-β1及其激活物血小板反应蛋白-1。因此，Ast-Tbr2DN小鼠的近红外TGFβ信号的正常上调被减弱。在这种TGFβ信号转导降低和神经炎症过度的情况下，我们观察到光凝性运动皮层卒中后运动预后恶化和晚期梗死扩大。综上所述，这些数据表明，TGFβ信号传导是星形胶质细胞在中风后亚急性期限制神经炎症、激活近梗死皮层中的TGFβ并保护大脑功能的分子机制。

关键词：星形胶质细胞；细胞因子；免疫；炎症；缺血。

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数字

图1
图1。Ast-Tbr2DN小鼠星形胶质细胞中TGFβ信号被特异性抑制
答：。TGFβ途径活化标记物pSmad2与GFAP共定位的代表性图像+dMCAO后24小时野生型小鼠近端皮质的细胞核。注意，星形胶质细胞并不是对TGFβ有反应的唯一细胞类型。阿罗，GFAP+在dMCAO后表达pSmad2的细胞。比例尺，20μm。B。Ast-Tbr2DN小鼠模型示意图。四环素反式激活蛋白（tTA）由GFAP启动子驱动。tTA然后结合双向bi-tetO启动子驱动两个基因eGFP和显性阴性突变型II TGFβ受体Ast-Tbr2DN-Tbr2。C、。dMCAO（D2）后2天，Ast-Tbr2DN小鼠未受损皮层（假）和近梗死皮层eGFP表达的代表性图像。比例尺，200μm。D。显示GFAP中特定eGFP表达的代表性图像+Ast-Tbr2DN小鼠的细胞。比例尺，50μm。E、 F、。电子GFP+dMCAO后24小时，Ast-Tbr2DN小鼠的星形胶质细胞表现出pSmad2核表达的可能性低于对照组。代表性图片(E类)和量化(F类). 箭头，典型的GFAP+/电子GFP+不表达核pSmad2的细胞。比例尺，20μm。N=每组4只小鼠，100 GFAP+每个小鼠的细胞数。棒材，平均值±SEM*P（P）<0.05,**P（P）<0.01，单因素方差分析，Bonferroni校正，与假阳性或野生型进行比较。
图2
图2。抑制星形细胞TGFβ信号转导在dMCAO后亚急性期增加近梗死皮质的炎症反应
A、 B。代表性流式细胞仪图(A类)和量化(B类)CD11b的+CD45培养基和CD11b+Ast-Tbr2DN小鼠和野生型对照组近端皮质中CD45高单核细胞。C、。dMCAO后3天，沿吻-尾轴跨近梗死皮质的CD68免疫染色代表性图像。显示最大行程的冠状切面被任意指定为0μm，CD68+Ast-Tbr2DN小鼠嘴侧（-1920μm）和尾侧至该位置（+192μm）的细胞激活更为显著，比例尺为200μm。D。dMCAO后3天，CD68免疫染色定量显示，在Ast-Tbr2DN小鼠中，CD68活化的扩散范围更广。E、 F、。代表性图片(E类)和量化(F类)dMCAO后3天，近梗死区皮质的MHC II免疫染色。比例尺，100μm。G.公司。Ast-Tbr2DN小鼠和野生型对照中iNOS mRNA的定量。N=6-12只/组。棒材，平均值±SEM*P（P）<0.05，学生t检验。
图3
图3。抑制星形细胞转化生长因子β信号传导不会影响脑卒中大小或dMCAO后早期星形细胞瘢痕形成
答：。Ast-Tbr2DN小鼠和野生型对照组梗死面积的量化。B、 C、。代表性图片(B类)和量化(C类)dMCAO后3天，反应性星形胶质细胞标记物GFAP在Ast-Tbr2DN小鼠和野生型对照小鼠近梗死皮层的表达。比例尺，500μm。D、 E类胶质瘢痕成分纤维连接蛋白-1的定量(D类)和tenascin-C(E类)dMCAO后2天的mRNA水平。
图4
图4。dMCAO后亚急性期，星形胶质细胞TGFβ信号需要上调近梗死皮质功能性TGFβ
答：。采用发光分析法对dMCAO后2天Ast-Tbr2DN小鼠和野生型对照小鼠近端和对侧皮层中细胞因子和趋化因子的表达进行聚类分析。热图表示日志2标准化蛋白质表达水平。白色方块，蛋白质无法检测。白色矩形表示TGF-β1，这是Ast-Tbr2DN小鼠和野生型对照组之间唯一存在显著差异的细胞因子。B。dMCAO后2天，使用发光分析法定量Ast-Tbr2DN小鼠和野生型对照小鼠近梗死皮层中的TGFβ水平。C、。用ELISA法对基线检查时和dMCAO后2天的近梗死区皮质中TGF-β1水平进行定量。D。Ast-Tbr2DN小鼠和野生型对照组在基线检查和dMCAO后2天TGFβ激活物血小板反应蛋白-1（Thbs1）mRNA水平的定量。每组N=5-6只小鼠。棒材，平均值±SEM*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，Student t检验和双向方差分析（基因型和时间之间的相互作用）。
图5
图5。抑制星形胶质细胞TGFβ信号转导减少近梗死区皮层的TGFβ整体信号转导
A至D。基线时野生型对照组和Ast-Tbr2DN小鼠近端皮质TGFβ下游信号传导介质Smad2及其活化磷酸化形式pSmad2的定量(A、 B类)dMCAO后2天(C、 D类). 典型的Western blot图像(A、 C类)和量化(B、 D类).E、 F、。典型的Western blot图像(E类)和量化(F类)dMCAO后2天野生型对照组和Ast-Tbr2DN小鼠近端皮质中TGFβ下游信号介质Akt磷酸化.G.（通用）。dMCAO后2天野生型对照组和Ast-Tbr2DN小鼠中pAkt与神经元核标记NeuN和核标记DAPI共同定位的代表性图像。比例尺，20μm。箭头，野生型神经元细胞核显示pAkt免疫染色。星号，Ast-Tbr2DN神经元细胞核未显示pAkt免疫染色。H。dMCAO后2天野生型对照组和Ast-Tbr2DN小鼠中pAkt与神经元核标记物NeuN共同定位的量化。每组N=5-6只小鼠。棒材，平均值±SEM*P（P）<0.05, ***P（P）<0.001，学生t检验。
图6
图6。Ast-Tbr2DN小鼠在光血栓中风后4周内出现更大的梗死和更差的运动结果
A、 B。与野生型对照组相比，Ast-Tbr2DN小鼠梗死面积增加倍数的量化(A类)和28天(B类)光凝性卒中后。棒材，平均值±SEM*P（P）<0.05，学生t检验。C、。使用梁平衡测试量化光血栓卒中后前四周的运动结果。D-H公司。使用肢体对称性测试对光致变色性卒中后前四周的运动结果进行量化(D类)，前肢力量(E类)，横向转弯(F类)、前肢行走(G公司)和攀登(H（H）).一、。综合运动测试分数。N=10-12只/组。棒材，平均值±SEM*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，Mann-Whitney检验和重复测量方差分析检验基因型之间的差异。
图7
图7。脑卒中后星形胶质细胞TGFβ信号转导功能模型
TSP-1、血小板反应蛋白-1；TGFβ，转化生长因子β。
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