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.2014年7月;34(13):2382-95.
doi:10.1128/MCB.01602-13。 Epub 2014年4月14日。

异硫氰酸苯乙酯和其他活性氧诱导抗癌药物的作用机制

附属公司

异硫氰酸苯乙酯和其他活性氧诱导抗癌药物的作用机制

英迪拉·朱图鲁等。 分子细胞生物学. 2014年7月.

摘要

活性氧(ROS)诱导的抗癌药物,如异硫氰酸苯乙酯(PEITC),激活应激途径以杀死癌细胞。在此,我们证明PEITC诱导的ROS降低了microRNA 27a(miR-27a)/miR-20a:miR-17-5p的表达,并诱导了miR-调节的ZBTB10/ZBTB4和ZBTB34转录阻遏物,这反过来又下调胰腺癌细胞中的特异性蛋白(Sp)转录因子(TFs)Sp1、Sp3和Sp4。PEITC诱导的ROS降低miR-27a/miR-20a:miR-17-5p的表达是触发miR-ZBTB-Sp级联导致Sp-TFs下调的关键步骤,这是由于与阻遏物复合物全基因组转移相关的ROS依赖性表观遗传效应,导致Myc和Myc-regulated miRs表达降低。RNA干扰单独敲除Sp1也可诱导胰腺癌细胞凋亡,降低胰腺癌细胞的生长和侵袭,表明下调Sp转录因子是PEITC和其他ROS诱导的抗癌药物的重要共同作用机制。

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图1
图1
PEITC抑制胰腺癌细胞生长并诱导ROS。(A) 用不同浓度的PEITC处理L3.6pL、Panc28和Panc1细胞长达72小时,并按照材料和方法中的概述对细胞进行计数。用PEITC或玉米油(对照)治疗后的相对肿瘤重量按照材料和方法中的概述进行测定(P(P)<0.05)体重下降(*)(每个治疗组10只动物)。用20μM PEITC、GSH或其组合处理L3.6pL(B)、Panc28(C)和Panc1(D)细胞3和6 h,并使用材料和方法中描述的细胞发酵CM-H2DCFDA染料通过FACS分析测定ROS;对3小时和6小时后观察到的效果进行了量化(在重复实验中获得了类似的结果)。
图2
图2
PEITC破坏线粒体结构并降低MMP。用20μM PEITC单独(A)或与GSH(B)联合处理L3.6pL、Panc28和Panc1细胞,并用TEM测定线粒体超微结构,如材料和方法所述。场的宽度为2μm(A)和5.3μm(B)。(C) 用二甲基亚砜(溶剂)、20μM PEITC或5 mM GSH或GSH加PEITC处理细胞指定时间,并按照材料和方法中所述,通过JC-1染色测定MMP的变化。结果为平均值±SE(每个数据点重复3次),且显著(P(P)<0.05)表明GSH(**)抑制(*)和逆转作用。红色,JC-1骨料;绿色,JC-1单体。
图3
图3
谷胱甘肽抑制PEITC诱导的细胞凋亡和生长抑制。用20μM PEITC或GSH单独或联合处理(A至C)L3.6pL(A)、Panc28(B)和Panc1(C)细胞,并按照材料和方法中的概述测定膜联蛋白V染色。(D) 细胞增殖。按照面板A至C所述处理细胞24小时;然后按照材料和方法中的概述对细胞进行计数。结果为平均值±SE(每个数据点重复3次),且显著(P(P)<0.05)表明了PEITC(*)的作用和GSH(**)共同处理的衰减。
图4
图4
PEITC下调Sp1、Sp3、Sp4和Sp调节基因。(A至C)用不同浓度的PEITC处理胰腺癌细胞24 h,并通过Western blotting分析全细胞裂解物中的Sp1、Sp3和Sp蛋白(A)、前生存蛋白(B)以及生长促进和血管生成蛋白(C),如材料和方法中所述。(D) 用PEITC或GSH单独或联合处理细胞,用Western blotting分析细胞裂解物,如面板A至C所示。结果是典型的重复分析,其结果具有可比性。(E) 携带L3.6pL细胞作为异种移植物的对照组和PEITC处理的动物的肿瘤裂解物的蛋白质印迹以及相对于对照组的蛋白质定量。面板A至C中显示的数据来自相同的实验。
图5
图5
(A和B)胰腺癌细胞中Sp1的促癌活性。细胞生长(A)和细胞周期进展(B)。用沉默Sp1的两种不同寡核苷酸(siSp1I和siSp1II)转染Panc1和L3.6pL细胞,并根据材料和方法中的细胞计数或FACS分析确定细胞增殖和细胞周期进展。(C和D)胰腺癌细胞侵袭和定量(C)和诱导凋亡(D)。用siSpI或siSp1II转染Panc1和L3.6pL细胞,根据材料和方法中的概述,在Boyden小室试验中测定并量化细胞迁移抑制和凋亡诱导。每个治疗组至少3次重复测定的A组至C组结果以平均值±SE表示,且显著(P(P)<0.05)表明与对照组(siCT)相比增加(*)或减少(**)。
图6
图6
PEITC干扰miR-ZBTB相互作用。(A) PEITC降低miR表达。用20μM PEITC处理胰腺癌细胞24小时,并按照材料和方法中的概述,通过实时PCR测定miR的表达。(B) GSH减弱PEITC介导的miR下调。用20μM PEITC、5 mM GSH单独或PEITC和GSH联合处理细胞24 h,并分析miR表达,如A组所述。(C)诱导ZBTB表达。按照B组所述处理细胞,根据材料和方法中所述,通过实时PCR测定ZBTB4、ZBTB10和ZBTB34 mRNA水平,并指示显著诱导(*)(3次重复测定的平均值±SE)。(D) ZBTB蛋白表达。用20μM PEITC对细胞进行不同时间的处理,并按照材料和方法中的概述,通过Western blotting测定ZBTB蛋白的表达。每个治疗组至少3次重复实验的A组至C组结果表示为平均值±SE;重要的(P(P)<0.05)显示了PEITC诱导的反应(*)和GSH的衰减(**)。
图7
图7
PEITC诱导的反应是由于Myc的下调。(A) 时间进程对Sp转录因子和Myc的影响。用20μM PEITC处理细胞不同时间,并按照材料和方法中概述的方法进行蛋白质印迹分析。(B) GSH通过PEITC减弱Myc下调。用20μM PEITC或5 mM GSH单独处理细胞,或PEITC和GSH联合处理细胞24 h,并按照材料和方法中的概述通过Western blotting分析全细胞裂解物。(C和D)cMyc、Sp1、ACTB(C)和miR启动子(D)的ChIP分析。用20μM PEITC处理细胞3 h,在材料和方法中概述的ChIP分析中测定Myc、ACTB和Sp1启动子(C)上的组蛋白甲基化和乙酰化标记以及与miR-23a/27a和miR-17-92启动子(D)的Myc结合。结果代表了重复测定,所用的各种引物(C和D)列于材料和方法中。
图8
图8
Myc敲除破坏miR-ZBTB相互作用并下调Sp蛋白。(A) 胰腺癌细胞中RNA干扰(siMyc)对Myc的敲除降低了miR的表达。用siMyc或非特异性寡核苷酸(siCtrl)转染Panc1、Panc28和L3.6pL细胞,并按照材料和方法中的概述,通过实时PCR测定miR-20a和miR-27a的表达水平。(B) Myc过度表达抑制PEITC介导的miR-20a和miR-27a抑制。用20μM PEITC处理Panc1、Panc28和L3.6pL细胞,并用Myc表达质粒(pMyc)或空载体(pcDNA3)转染,按照材料和方法中的概述,通过实时PCR测定miR-20a和miR-27a的表达。(C) Myc敲除降低胰腺癌细胞中的Sp蛋白。用siMyc或siLamin(对照)转染Panc1、Panc28和L3.6pL细胞,并按照材料和方法中的概述通过Western blotting分离和分析全细胞裂解物。(D) 提出了ROS诱导Sp转录因子下调的机制。面板A和B中显示的结果是重复测定的平均值±SE,显著(P(P)>0.05)表达减少(*)和抢救(**)。表明Myc过度表达显著上调(***)。

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