The NS5A-binding heat shock proteins HSC70 and HSP70 play distinct roles in the hepatitis C viral life cycle

doi:10.1016/j.virol.2014.02.016

。2014年4月：454-455:118-27。

doi:10.1016/j.virol.2014.02.016。 Epub 2014年2月28日。

NS5A结合热休克蛋白HSC70和HSP70在丙型肝炎病毒的生命周期中起着不同的作用

附属公司

¹美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院病理学和实验医学系。电子地址：RnKhch@ucla.edu。
²美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院病理学和实验医学系。电子地址：GEkambaram@ucla.edu。
^三美国加州大学洛杉矶分校化学与生物化学系。电子地址：YasAhmadieh@ucla.edu。
⁴美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院分子生物学研究所分子生物学跨部门博士项目（MBIDP）；美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院分子生物学研究所。电子地址：Wheatley.NM@gmail.com。
⁵美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院人类遗传学系。电子地址：Christopher.Sundberg@gmail.com。
⁶美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院医学系。电子地址：CLJung@mednet.ucla.edu。
⁷美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院分子和医学药理学系；美国加利福尼亚州洛杉矶Cedars-Sinai医疗中心再生医学研究所外科。电子地址：Vaithi.Arumugaswami@cshs.org。
⁸美国加利福尼亚州洛杉矶加利福尼亚大学David Geffen医学院微生物、免疫学和分子遗传学系。电子地址：SRaychau@ucla.edu。
⁹美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院微生物学、免疫学和分子遗传学系；美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院约翰逊综合癌症中心；加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所，美国加利福尼亚大学戴维·格芬医学院。电子地址：Dasgupta@ucla.edu。
¹⁰美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院病理学和实验医学系；美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院约翰逊综合癌症中心；加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所，美国加利福尼亚大学戴维·格芬医学院。电子地址：SFrench@mednet.ucla.edu。

PMID： 24725938
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内政部： 2016年10月10日/j.virol.2014.02.016

NS5A结合热休克蛋白HSC70和HSP70在丙型肝炎病毒的生命周期中起着不同的作用

罗尼克·哈查图利安等。病毒学。 2014年4月。

。2014年4月：454-455:118-27。

doi:10.1016/j.virol.2014.02.016。 Epub 2014年2月28日。

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¹美国加利福尼亚州洛杉矶加利福尼亚大学大卫·格芬医学院病理学和实验医学系。电子地址：RnKhch@ucla.edu。
²美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院病理学和实验医学系。电子地址：GEkambaram@ucla.edu。
^三美国加州大学洛杉矶分校化学与生物化学系。电子地址：YasAhmadieh@ucla.edu。
⁴美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院分子生物学研究所分子生物学跨部门博士项目（MBIDP）；美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院分子生物学研究所。电子地址：Wheatley.NM@gmail.com。
⁵美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院人类遗传学系。电子地址：Christopher.Sundberg@gmail.com。
⁶美国加利福尼亚州洛杉矶加利福尼亚大学大卫·格芬医学院医学系。电子地址：CLJung@mednet.ucla.edu。
⁷美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院分子和医学药理学系；美国加利福尼亚州洛杉矶Cedars-Sinai医疗中心再生医学研究所外科。电子地址：Vaithi.Arumugaswami@cshs.org。
⁸美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院微生物学、免疫学和分子遗传学系。电子地址：SRaychau@ucla.edu。
⁹美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院微生物学、免疫学和分子遗传学系；美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院约翰逊综合癌症中心；加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所，美国加利福尼亚大学戴维·格芬医学院。电子地址：Dasgupta@ucla.edu。
¹⁰美利坚合众国加利福尼亚州洛杉矶加利福尼亚大学David Geffen医学院病理学和实验医学系；美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院约翰逊综合癌症中心；加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所，美国加利福尼亚大学戴维·格芬医学院。电子地址：SFrench@mednet.ucla.edu。

PMID： 24725938
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内政部： 2016年10月10日/j.virol.2014.02.016

摘要

我们之前在蛋白质组学筛选中确定HSP70和HSC70与NS5A的复合物。在这里，联合免疫沉淀研究证实了感染期间NS5A/HSC70复合物的形成，免疫荧光研究表明NS5A和HSC70共定位。与HSP70不同，HSC70敲除并没有降低病毒蛋白水平。相反，HSC70敲除显著损害了细胞内感染性病毒组装。我们还发现HSC70核苷酸结合域和底物结合域都能直接结合NS5A，而只有HSP70核苷酸结合区能。HSC70和HSP70的敲除证明了病毒产生的额外减少。这一数据表明HSC70和HSP70在病毒的生命周期中起着不同的作用。对这些不同功能的研究可能有助于开发以宿主蛋白为靶点的治疗HCV感染的新策略。

关键词：装配；丙型肝炎病毒；HSC70；热休克蛋白70；IRES；NS5A。

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数字

图1
HSC70直接绑定NS5A在体外通过其核苷酸结合域（NBD）和底物结合域（SBD），不结合HSP70。所有面板均显示表面等离子共振（SPR）分析。固定化和注射的蛋白质如图例所示。对于所有分析，注射时间为180秒，然后是180秒的分离。在面板A和D–H中，从HSC70结构体的结合中减去人血清白蛋白（HSA）的结合信号（阴性对照）（即HSA结合设置为零反应单位）。**答：。**全长HSC70直接与NS5A结合。B。人胰岛素不与NS5A结合。**C、。**人胰岛素不与HSP70结合。D。HSC70-NBD直接与NS5A结合。**E.公司。**HSC70-SBD直接与NS5A结合。**F、。**全长HSC70不结合HSP70。**G.公司。**HSC70-NBD不绑定HSP70。H。HSC70-SBD不结合HSP70。

图1
HSC70直接绑定NS5A在体外通过其核苷酸结合域（NBD）和底物结合域（SBD），不结合HSP70。所有面板均显示表面等离子共振（SPR）分析。固定化和注射的蛋白质如图例所示。对于所有分析，注射时间为180秒，然后是180秒的分离。在图A和D–H中，从HSC70构建体的结合中减去人血清白蛋白（HSA）的结合信号（阴性对照）（即HSA结合设置为零反应单位）。**答：。**全长HSC70直接与NS5A结合。B。人胰岛素不与NS5A结合。**C、。**人胰岛素不与HSP70结合。D。HSC70-NBD直接与NS5A结合。**E.公司。**HSC70-SBD直接与NS5A结合。**F、。**全长HSC70不结合HSP70。**G.公司。**HSC70-NBD不绑定HSP70。H。HSC70-SBD不结合HSP70。

图2
HSC70与NS5A相互作用体内共免疫沉淀试验表明HSC70与感染细胞中的NS5A结合。Huh-7.5细胞感染72小时后收获。用HSC70抗体免疫沉淀感染和未感染对照细胞的细胞裂解液，然后进行Western分析。

图3
HSC70与NS5A共存体内免疫荧光分析显示HSC70和NS5A共定位体内感染Huh-7.5细胞48小时，然后用HSC70和NS5A抗体进行同步免疫荧光染色。**答：。**HSC70（蓝色）。B。NS5A（红色）。**C、。**HSC70和NS5A的免疫荧光染色（粉红色）。D。显示HSC70和NS5A共定位的散点图。**E.公司。**表中显示了HSC70与NS5A（M1）共定位以及NS5A与HSC70（M2）共定域的Manders重叠系数。对四个独立的免疫荧光实验进行重叠分析。

图4
siRNA介导的HSC70敲除对细胞无细胞毒性。**答：。**MTT分析表明，在siRNA转染后96小时，HSC70的敲除没有任何细胞毒性作用。B。用上述siRNAs处理的细胞的西方分析。**C、。**面板B中Western blot的密度测定。

图5
siRNA-介导的HSC70敲除显著降低病毒生成。**答：。**细胞内病毒产生试验表明，HSC70的敲除导致细胞内病毒水平显著降低。B。长期感染性病毒分泌试验表明，HSC70的敲除显著降低了感染性病毒的分泌。

图6
shRNA-介导的HSC70敲除显著降低病毒生成。**答：。**针对HSC70、HSP70或两者的shRNAs处理细胞的西方分析。B。面板A中Western blot的密度测定。**C、。**细胞内病毒产生测定表明，敲低HSC70导致细胞内病毒水平显著降低。

图7
HSC70的敲除不影响病毒RNA复制和NS5A增强的IRES介导的翻译。**答：。**定量逆转录酶PCR（qRT-PCR）分析表明HSC70的敲除并不影响病毒RNA的复制。B。C部分双重荧光素酶分析中使用的双顺反子报告子结构示意图。该结构包含*雷尼利亚*荧光素酶和*萤火虫*荧光素酶ORF分别受5′-帽和HCV IRES的控制。比率*萤火虫*到*雷尼利亚*测量结果表明IRES介导的翻译。**C、。**IRES分析表明HSC70的敲除并不能降低NS5A增强的IRES介导的翻译。

图8
HSC70的敲除不影响细胞内病毒蛋白的产生。**答：。**细胞内病毒蛋白产生试验表明，HSC70的敲除不会降低细胞内病毒蛋白质的产生。Huh-7.5细胞用抗HSC70、HSP70的siRNA或其相应的对照siRNA处理，并在24小时后感染报告病毒。在感染后的指定时间点，采集细胞并测量荧光素酶活性。B。与上述分析的24小时时间点对应的条形图。

图9
HSC70的敲除显著降低细胞内感染病毒的组装。**答：。**细胞内感染病毒粒子组装试验表明，HSC70的敲低显著抑制病毒粒子组装。B。短期感染性病毒分泌试验表明HSC70基因敲除对病毒分泌的影响。

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