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.2014年4月8日；9（4）：e94656。
doi:10.1371/journal.pone.0094656。 2014年电子收集。

nairovirus nairobi绵羊病病毒/甘贾姆病毒诱导蛋白质二硫醚异构酶样氧化还原酶从内质网转移到细胞表面和细胞外空间

利迪娅·拉塞卡 1, 迈克尔·D·拜伦 1
附属公司

nairovirus nairobi绵羊病病毒/甘贾姆病毒诱导蛋白质二硫醚异构酶样氧化还原酶从内质网转移到细胞表面和细胞外空间

利迪娅·拉塞卡等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

奈罗病毒属内罗毕绵羊病病毒（NSDV）引起绵羊和山羊出血性胃肠炎，死亡率高达90%；这种病毒在东非和中非以及印度被发现，在那里这种病毒被称为甘贾姆病毒。NSDV与人类病原体克里米亚-刚果出血热病毒密切相关，该病毒也会引起出血性疾病。与其他奈洛韦病毒一样，NSDV的复制发生在细胞质中，新病毒颗粒发芽进入高尔基体；然而，病毒复制对细胞隔室的影响尚未得到广泛研究。我们发现内质网（ER）、内质网-高尔基体中间区室和高尔基体的整体结构不受NSDV感染的影响。然而，我们观察到，NSDV感染导致内质网管腔中存在的一种氧化还原酶，即蛋白质二硫醚异构酶（PDI）从内质网中丢失，该酶有助于蛋白质折叠。进一步研究表明，NSDV-感染细胞的表面PDI水平较高，PDI也分泌到感染细胞的培养基中。PDI家族的另一个伴侣ERp57也受到了类似的影响。对感染细胞的分析和单个病毒糖蛋白的表达表明，NSDV PreGn糖蛋白参与这些可溶性ER氧化还原酶的再分配。有研究表明，细胞外PDI可以激活整合素和组织因子，这两种因子分别参与促炎反应和弥散性血管内凝血，这两者都表现在许多病毒性出血热中。NSDV感染细胞PDI分泌增强的发现可能是了解出血性奈拉病毒致病机制的重要发现。

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数字

图1
图1。NSDV复制对ERGIC和高尔基体无明显影响。
Vero细胞感染NSDVi分离物，MOI为0.3 TCID5016小时后，用3%PFA固定细胞，然后用冰镇甲醇固定。细胞与小鼠抗ERGIC53（ERGIC；a–c）、小鼠抗GM130共同染色(顺式高尔基；d–f）或大鼠抗p102(反式高尔基；g–i）和兔抗病毒N蛋白的抗血清。通过与Alexa Fluor 488山羊抗鼠或抗鼠IgG（绿色）和Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG共同染色来观察蛋白质。使用DAPI（蓝色）对细胞核进行复染。棒材对应20μm。
图2
图2。NSDV感染的细胞在ER中显示PDI和ERp57水平降低。
实验如图1所示，但细胞与小鼠抗PDI（克隆1D3；a–c）、小鼠抗PDI（克隆RL90；d–f）、兔抗ERp57（g–i）或小鼠抗calnexin（j–l）以及兔抗病毒N蛋白抗血清共同染色。随后，通过与Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG（绿色）和Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG的共同染色（红色）（a–f和j–l），对蛋白质进行可视化，但g–i除外，其中兔抗ERp57 IgG用Zenon Alexa Fuoro 488兔子IgG标记试剂（绿色）标记用Zenon Alexa Fluor 594兔IgG标记试剂（红色）标记兔抗-N IgG。棒材相当于40μm。
图3
图3。PDI和ERp57在NSDV感染的细胞中似乎没有降解。
Vero细胞在MOI为5 TCID时感染NSDVi分离物50或者没有感染。16小时后，通过裂解收集细胞，并在丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶上分离蛋白质；使用PDI（克隆RL90）、ERp57、calnexin（CNX）、，顺式高尔基（GM130），反式高尔基体（p102）、PCNA和NSDV N蛋白。
图4
图4。PDI和ERp57出现在NSDV感染的细胞表面。
答：。按照图1制备样品，但用3%PFA固定后，用小鼠抗PDI（克隆1D3；a–c）、小鼠抗PDI（克隆RL90；d–f）或兔抗ERp57（g–i）标记细胞。然后再次用3%PFA固定细胞，用冰镇甲醇打开，用兔抗病毒N蛋白（a–f）抗血清或小鼠抗PreGn抗体（g–i）染色。通过与Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG（绿色）和Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG（红色）共染色来观察蛋白质。B。Vero细胞在6 TCID的MOI中感染了NSDVi分离物50或者没有感染。16小时后，用3%PFA固定细胞，使其不渗透。细胞与小鼠抗PDI（克隆1D3）抗体孵育，然后与Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG（绿色）孵育。使用DAPI（蓝色）对细胞核进行复染。棒材相当于40μm。
图5
图5。NSDV感染对PDI在山羊内皮细胞系（CJE）中分布的影响。
CJE细胞（一种山羊内皮细胞系）在6 TCID的MOI下感染NSDVi分离物5072小时后，用3%的PFA固定细胞，然后用冰镇甲醇（a–c）或仅用3%PFA（d–f）固定细胞。细胞用小鼠抗PDI（克隆1D3）抗体和兔抗病毒N蛋白（a–c）抗血清共同染色，或仅用小鼠抗-PDI抗体染色，然后再次用3%PFA固定，然后用冰镇甲醇处理，并用兔抗N蛋白（d–f）抗血清染色。蛋白质由Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG（绿色）和Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG进行可视化。使用DAPI（蓝色）对细胞核进行复染。条形对应于40μm；“a”和“d”中的箭头表示受感染的细胞。
图6
图6。NSDV感染细胞PDI变化的时间进程。
Vero细胞在6 TCID的MOI中感染了NSDVi分离物50固定在8、12和16hpi。对于内部染色（a–i），使用3%PFA固定细胞，然后使用冰镇甲醇。细胞与小鼠抗PDI（克隆1D3）抗体和兔抗病毒N蛋白抗血清共同染色。对于表面PDI染色（j–l），细胞用3%PFA固定，然后用小鼠抗PDI（克隆1D3）抗体染色。然后再次用3%PFA固定细胞，用冰镇甲醇打开，用兔抗N蛋白抗血清检测病毒。用Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG（绿色）和Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG，对蛋白质进行可视化。使用DAPI（蓝色）对细胞核进行复染。棒材对应16μm。
图7
图7。NSDV的复制诱导受感染细胞分泌PDI和ERp57。
Vero细胞感染NSDVi分离物，MOI为0.1 TCID50或者没有感染。48小时后，收集上清液和细胞；蛋白质在丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶上分离，并使用PDI（克隆RL90）、ERp57、病毒N蛋白、calnexin（CNX）或α-微管蛋白的特异性抗体通过Western blotting检测细胞和病毒蛋白。
图8
图8。病毒糖蛋白与PDI和ERp57的相关性。
答：。按照图1制备样品，但细胞与兔抗ERp57和鼠抗PreGn抗体共同染色，然后与Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG（绿色）和Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG共同染色（红色）。Bar对应于40μm。B。Vero细胞感染NSDVi分离物，MOI为0.1 TCID50或者没有感染。48小时后，收集细胞，并使用小鼠抗PDI（克隆RL90）抗体和蛋白G-琼脂糖珠从细胞裂解液中免疫沉淀蛋白（IP）。蛋白质在丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶上分离，并使用抗PreGn、抗PDI或抗N抗体通过Western blotting（WB）检测。
图9
图9。NSDV糖蛋白表达对PDI的影响。
用1μg pCAGGs_MCSII_PreGn_V5（a–c和j–l）、pCAGs_MCCII_PreG c_V5M（M）_V5（g–i）。24小时后，用3%PFA固定细胞，然后用冰镇甲醇固定，并用小鼠抗PDI（a–i）或抗calnexin（j–l）抗体染色，然后用Alexa Fluor 568山羊抗小鼠IgG（红色）染色。用与Alexa Fluor 488（绿色）偶联的小鼠抗V5抗体对质粒表达蛋白进行可视化。使用DAPI（蓝色）对细胞核进行复染。棒材相当于40μm。a–b和j–k中的箭头表示表达PreGn的细胞。
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