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.2014年4月1:5:3550。
doi:10.1038/ncomms4550。

酸中毒超越缺氧以维持线粒体功能和细胞存活

米雷尔·卡乔 1, 米歇尔·塔拉拜 1, 大卫·彭定康 2, 帕梅拉·卡乔 2, 杰森·G·麦克劳林 1, 詹妮弗·瓜达格诺 3, 理查德·贝杰伦 4, 肖恩·克里根 3, 玛丽·埃伦·哈珀 5, 大卫·S·帕克 1, 露丝·S·斯拉克 1
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酸中毒超越缺氧以维持线粒体功能和细胞存活

米雷尔·卡乔等。 国家公社. .
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摘要

高能量需求的有丝分裂后细胞的持续细胞功能和生存能力依赖于ATP的持续供应。线粒体氧化磷酸化在高效ATP生成中的利用是氧水平的函数。因此，在生理或病理环境中，缺氧对细胞代谢和生存有着深远的影响。这里我们表明，轻度细胞外酸中毒（厌氧代谢的生理后果）可以重新编程线粒体代谢途径，以保持有效的ATP生成，而不管氧气水平如何。酸中毒启动了一个快速可逆的体内平衡程序，通过调节线粒体动力学和嵴结构来重组线粒体，以重新配置线粒体效率，维持线粒体功能和细胞生存。防止线粒体重塑会导致线粒体功能障碍、断裂和细胞死亡。我们的发现挑战了氧可用性是氧化代谢关键限制因素的概念，并提出了线粒体形态可以决定有丝分裂后细胞的生物能量状态的概念。

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数字

图1
图1。细胞外酸化重构有丝分裂后细胞中的线粒体。
(一)在SD或AP培养基中，在常氧（Norm.）或缺氧（Hyp.）条件下培养18小时后，培养皮层神经元线粒体形态的典型共焦图像。用Tom20免疫荧光观察线粒体。右边的面板代表线粒体的放大视图(b条)线粒体长度(一)被量化并分为不同长度类别。表示为平均值和标准差(n个图中所示的值）。Ctr=对照；代表在神经基底介质中培养的神经元。(c（c）)Tom20染色显示的Tuj1+皮层神经元在指定条件下线粒体形态的代表性图像。(d日和e（电子）)在指定条件下培养的CGN在培养18小时后的线粒体形态。插入（英寸）(d日)是线粒体的放大视图(e（电子）)平均值和标准差(n个=3）线粒体长度数据(d日). (（f）和克)线粒体形态学体外海马切片在常压下孵育4小时 h。神经元用NeuN（神经元特异性核蛋白）和Tom20（线粒体）进行免疫染色。显示Tom20/NeuN染色的面板是海马体内方框区域的放大视图。箭头表示线粒体拉长(克)绘制了指示条件下的平均线粒体长度和标准差*P（P）<0.05; **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001（学生t吨-测试）。对于所有图像，比例尺=10 微米。
图2
图2。酸中毒介导的线粒体伸长具有pH-特异性、快速性、可逆性和O2-和葡萄糖非依赖性。
(一)缺氧条件下固定pH值下培养的皮层神经元线粒体形态的典型共焦图像。Ctr=对照；代表在神经基底介质中培养的神经元。(b条)平均线粒体长度和s.d(n个=3）绘制了指示pH值。(c（c）)平均线粒体长度和s.d(n个=3）在指定条件下随时间变化。(d日)Tom20（线粒体）的免疫荧光显示在指定时间因生理性酸中毒导致皮质神经元线粒体长度的变化。(e（电子）)平均值和标准差(n个=3）在正常氧条件下，指示pH值下线粒体长度分布6 小时(（f）)平均值和标准差(n个=3）正常氧或缺氧条件下低浓度（5.5）时线粒体长度分布 mM）或高（25 mM）葡萄糖水平6 小时(克和小时)在pH 6.5的AP-Hypoxia中孵育6小时后以及在指定pH值下复氧后的线粒体形态分析。(小时)线粒体平均长度（s.d。，n个=3）在指示条件下，在pH 6.5的AP-Hypoxia中培养6小时。(我)平均线粒体长度和s.d(n个=3）绘制了指示条件。ns=不显著*P（P）<0.05; **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001（学生的t吨-测试）。对于所有图像，比例=10 微米。
图3
图3。轻度酸中毒抑制DRP1介导的线粒体分裂。
(一)通过使用共聚焦成像对皮质神经元中的DRP1和Tom20进行免疫荧光，使DRP1病灶在线粒体处共定位。箭头显示DRP1病灶位于线粒体。标度=5 微米。(b条)与线粒体共定位的DRP1病灶数量的量化，以平均值和标准差表示(n个=3). (c（c）)在指定条件下孵育6小时后，对培养皮层神经元的全细胞裂解液中的指定蛋白质进行Western blot。(d日)在存在或不存在裂变抑制剂Mdivi-1的SD或AP培养基中缺氧培养6小时后，共定位于线粒体的DRP1病灶数量的量化。(e（电子）)孵育3小时后指示蛋白质的蛋白质印迹 h，并使用抗DRP1抗体进行内源性（内源性）DRP1的免疫沉淀。
图4
图4。轻度酸中毒调节线粒体动力学。
(一)外源性表达的PA-GFP-Oct.激活后线粒体融合随时间变化的典型图像（以分钟为单位）。方框表示光激活区域，箭头表示线粒体内GFP信号的传播（通过外源性Mito-DsRed表达显示）。(b条)皮质神经元线粒体融合的量化，作为激活区域GFP荧光的损失。数据表示n个=10（控制）和n个=17（实验），来自三个独立实验。(c（c）和d日)孵育6小时的皮层神经元全细胞裂解物中指示蛋白的Western blot h，在指定条件下。星号表示s-OPA1。(e（电子）)平均值和标准差(n个=3）与对照条件相比，酸中毒期间所示基因型的线粒体长度。(（f）)在所示条件下，在MES缓冲培养基中培养6小时后，来自所示基因型皮层神经元的线粒体形态代表性图像。每种情况的底部面板是线粒体的缩放视图。比例=10 微米*P（P）<0.05; ***P（P）<0.001（学生的t吨-测试）。
图5
图5。轻度酸中毒调节嵴结构。
(一,b条)在指定条件下，对活皮层神经元中BMH交联裂解物中的OPA1低聚物和单体进行Western blot。OPA1蛋白印迹已经拼接，以更好地阐明单体和寡聚OPA1出现的位置。图表示平均值和标准差(n个=3）OPA1低聚物的定量：单体比率。(c（c）–e（电子）)在指定条件下孵育6小时后线粒体超微结构的典型EM图像。比例=500 纳米。中的图形(d日,e（电子）)表示平均值和s.e.m(n个=10）用于量化嵴直径和嵴数。Ctr=对照表示在神经基底培养基中孵育的神经元。(（f）,克)代表性图像和量化（平均值和标准差。，n个=4）CPT在MES缓冲培养基中处理后CytC定位，pH 7.2或6.5，常压*P（P）<0.05; **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001（学生的t吨-测试）。
图6
图6。酸中毒介导的线粒体重塑保护神经元在缺氧应激期间免受细胞死亡。
(一)皮质神经元细胞死亡的平均值和标准差的量化(n个数值表示独立实验）。(b条)平均值和标准差(n个=3）用CPT在MES缓冲介质中在pH 7.2或6.5的常压下处理24小时后的神经细胞死亡分析。(c（c）)量化感染慢病毒的神经元在30天后的细胞死亡 h，在SD或AP介质中，在指定条件下（平均值和标准差。，n个=3). (d日)平均值和标准差(n个=4）WT（野生型）或MFN1缺陷（MFN1−/−）皮层神经元在SD或AP培养基中在指定条件下培养30小时后的细胞死亡定量。(e（电子）)在指定条件下，在SD或AP培养基中培养30小时后，定量感染腺病毒编码的GFP或DRP1-YFP的神经元的细胞死亡（平均值和标准差。，n个=3). *P（P）<0.05; **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001（学生的t吨-测试）。
图7
图7。酸中毒在缺氧应激期间维持线粒体功能。
(一)缺氧条件下SD或AP培养基中培养18小时后，TMRE染色和荧光强度定量。平均值和标准差(n个=3来自三个独立实验）。解偶联剂FCCP消散膜电位，用于显示所测TMRE荧光的特异性。(b条)相对于常氧控制的总ATP水平（黑色）。平均值和标准差(n个=5). (c（c）)稳定状态下（黑色）和寡霉素处理1小时后（灰色）每个细胞的总ATP浓度 在指定条件下处理h。平均值和标准差(n个=从六个独立实验中重复3次）。(d日)量化感染慢病毒编码干扰控制（shCtr）或OPA1-specific shRNA（shOPA1）的皮层神经元经1小时寡霉素治疗后的ATP耗竭量。平均值和标准差(n个=从三个独立实验中重复3次）。(e（电子）)寡霉素和6-DOG治疗后，每个细胞的ATP水平相对于初始值（黑色）。平均值和标准差(n个＝3个来自三个独立实验的重复）。(（f）)稳定状态下（黑色）和寡霉素处理1小时后（灰色）每个细胞的总ATP水平。图表示平均值和s.dn个=从六个独立实验中重复3次*P（P）<0.05; **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001（学生的t吨-测试）。
图8
图8。酸中毒引起线粒体呼吸效率的适应性重编程。
(一–d日)复合物V（ATP合酶）的代表性BN-PAGE(一)单体（整个细胞）和(c（c）)在指定条件下，经过6h处理后，皮层神经元中的二聚体（分离线粒体）。在(c（c）)，需要较长时间暴露膜才能观察到二聚体复合物V。图表示平均值和s.e.m(b条)n个=5和(d日)n个=3个独立实验。钼n个=单体，Dim=二聚体，CV=络合物V(e（电子）)使用抗NDUFA9（复合物I）、抗ATP5a（复合物V）和抗Core2（复合物II）的所示呼吸复合物的代表性BN-PAGE。皮层神经元治疗6次 h（在指定条件下）。SC 1–5=超级复杂组件。(（f）)使用抗NDUFA9（复合物-I）可视化的超复合物相对组装的量化。平均值和s.e.mn个=4个独立实验。(克,小时)使用抗NDUFA9（复合物I）、抗UQCRC2（复合物III）、抗复合物IV亚基1（复合物IV）和抗核心2（复合物II）的所示呼吸复合物的代表性BN-PAGE，6 h（在指定条件下）。中的图形(小时)平均值和s.e.mn个=6（络合物-I），n个=4（络合物III）和n个=3（复杂-IV）独立实验。(我,j）使用海马XF24细胞外通量分析仪对皮层神经元进行OCR。平均值和标准差(n个=从三个独立实验中重复4次）*P（P）<0.05; **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001（学生的t吨-测试）。
图9
图9。轻度酸中毒引起的线粒体重构决定了缺氧期间细胞的生物能量。
这幅漫画描绘了氧气水平下降后的一连串事件，以及轻度酸中毒在触发线粒体重组和重新编程以确定细胞生物能量学和细胞命运中的作用。上排：缺氧会导致线粒体断裂，失去有效的ATP生成，最终导致细胞死亡。下一排：缺氧期间轻度酸中毒可防止DRP1介导的分裂，并促进线粒体伸长（以SIMH依赖方式）和嵴重塑，以维持ATP水平和细胞存活。在我们的模型和实验中，“无酸中毒”和“轻度酸中毒”表明细胞外pH值分别为7.2和6.5缺氧'表示在1%氧气下孵育0–12 h、 12–21岁后被认为是“长期缺氧” 在1%氧气下孵育h。
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