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.2014年3月14日；9（3）：e92013。
doi:10.1371/journal.pone.0092013。 2014年电子收集。

极化上皮细胞中KCa3.1的顺次转运依赖于Rab1和Rab8，不依赖于回收内体

克劳迪娅·贝尔图乔 1, 李世良 2, 吴光裕 三, 迈克尔·B·巴特沃斯 1, 柯克·L·汉密尔顿 2, 丹尼尔·德沃 1
附属公司

极化上皮中KCa3.1的顺行运输是Rab1和Rab8依赖性的，并且是再循环内体依赖性的

克劳迪娅·贝尔图乔等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

中间电导，Ca2+激活的K+通道（KCa3.1）靶向极化上皮细胞的基底外侧膜，在跨上皮离子转运中起关键作用。然而，目前还没有研究确定KCa3.1在极化上皮中的顺行和逆行转运。在此，我们利用生物素连接酶受体肽（BLAP）标记的KCa3.1，利用MDCK、Caco-2和FRT细胞来解决极化上皮细胞中的这些转运步骤。我们证明，KCa3.1在过滤器支架上生长时，专门针对这些细胞中的BL膜。内吞作用后，通过抑制溶酶体/蛋白质体途径阻止KCa3.1降解。此外，KCa3.1的泛素化在BL膜的内吞作用后增加，而氘化酶抑制剂PR-619阻止降解，表明KCa3.1是泛素化降解的靶点。我们证明KCa3.1靶向缺乏AP-1复合物μ1B亚单位的极化LLC-PK1细胞的BL膜，表明KCa3.1的BL靶向与μ1B无关。由于Rabs 1、2、6和8在ER/Glgi退出和向BL膜转运蛋白质中发挥作用，我们评估了这些Rabs在转运KCa3.1中的作用。在显性阴性Rab1或Rab8存在的情况下，KCa3.1细胞表面表达显著降低，而Rabs 2和6没有影响。我们还与Rab1和Rab8共同免疫沉淀KCa3.1。这些结果表明，这些Rab是KCa3.1顺流贩运所必需的。最后，我们确定KCa3.1是直接转运到BL膜还是通过MDCK细胞中的内体再循环。在这些研究中，我们使用了循环内体消融或显性阴性RME-1构建体，并确定KCa3.1直接运输到BL膜，而不是通过循环内体。这些结果首次描述了KCa3.1在极化上皮细胞中的顺行和逆行运输。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。KCa3.1在极化上皮细胞中的定位和降解。
A类.BLAP-KCa3.1被转导到MDCK、Caco-2或FRT细胞中，这些细胞在Transwell®过滤器上生长汇合。使用重组BirA对基底膜（BL）和顶膜（AP）质膜KCa3.1通道进行特异性生物素化，并用链亲和素Alexa555（红色）标记用于IF定位，或用未结合的链亲和蛋白标记用于IB。顶膜与小麦胚芽凝集素（WGA）-Alexa488（绿色）联合标记，细胞核用DAPI（蓝色）标记用于IF定位。顶部面板显示通过细胞中间平面的单个共焦截面，底部面板显示z堆叠。对于IB实验，BL和AP膜在单独的Transwell过滤器上独立标记。每条车道装载30μg蛋白质。数据代表了3个单独的实验。经IF和IB评估，KCa3.1仅定位于BL膜。B类如上所述，KCa3.1在MDCK和Caco-2细胞的BL膜上生物素化，或在稳定表达BirA-KDEl/KCa3.1-BLAP的FRT细胞的ER水平生物素化并评估其随时间的降解。请注意每个单元格行使用的不同时间点。Tubulin被用作负荷控制。C类.B中所示斑点的量化，至少用于3个单独的实验*T方面P<0.05 = 0
图2
图2。BL定位的KCa3.1在溶酶体中降解。
BLAP-KCa3.1在生长于Transwell®过滤器和BL质膜通道上的Caco-2细胞中转导，BLA质膜通道被生物素化并用链霉亲和素标记。用leupeptin（100μM）和pepstatin（1μg/ml）（Leu/Pep）或lactacystin（10μM，Lacta）处理细胞，并测定KCa3.1的降解。Leu/Pep和Lacta都能抑制KCa3.1的降解。每条车道装载30μg蛋白质。下面绘制了3个实验的平均值*T方面P<0.05 = 0，#相对于T，P<0.05 = Caco-2细胞24小时。
图3
图3。KCa3.1在极化Caco-2细胞内吞后泛素化。
A.标记后，KCa3.1（红色）在Transwell®过滤器汇合Caco-2细胞中的IF定位，如图1 T所示 = 0及之后8小时，温度为37°C。8小时后，KCa3.1被内吞。细胞核用DAPI（蓝色）标记。B类.泛素化KCa3.1在T = 0，当KCa3.1定位于BL膜，并在内吞8小时和12小时后（见方法）。尽管通道被降解，但泛素化KCa3.1在8小时和12小时明显增加[链球菌（KCa3.1）印迹]。肌动蛋白被用作加载控制。C类PR-619（50μM）抑制氘化酶可防止KCa3.1降解。Leu/Pep被用作这些实验的对照。每条车道装载30μg蛋白质。肌动蛋白被用作负载对照。D类.量化C中所示的至少3个单独实验的斑点*T方面P<0.05 = 0，#相对于T，P<0.05 = 24小时。
图4
图4。DN Rab1和Rab8降低了质膜定位KCa3.1，但Rab2或Rab6没有降低。
用BLAP-KCa3.1和WT、DA或DN Rabs 1、2、6或8联合转染HEK293细胞，通过特异性生物素化、链霉亲和素标记和IB评估质膜定位KCa3.1（见方法）。如所示A类和C类DN Rab8（T22N）和两种不同的DN Rab1（N124I，S25N）降低质膜KCa3.1的表达。相反，DN Rab2和Rab6对KCa3.1的膜表达没有影响(B类和C类). 每条车道装载30μg蛋白质。中的条形图C类是3个实验的平均值*WT Rabs方面P<0.05。D类HEK293细胞与BLAP-KCa2.3和WT、DA或DN Rabs 1、2、6或8联合转染，膜定位KCa2.3如上评估。这些Rab对KCa2.3（n = 3).
图5
图5。KCa3.1免疫沉淀与Rab1和Rab8。
A类如方法所述，在HEK293细胞中对HA标记的KCa3.1和WT或DN Rab1（Flag）进行Co-IP。使用α-HA Ab（第5、6道）或α-V5 Ab作为IgG对照物（第3、4道）对总细胞裂解物进行IP，然后对Rab1（α-Flag）进行印迹。B类.HA标记的KCa3.1的Co-IP和内源性（底部面板）或GFP标记的WT和DN Rab8（顶部面板）。总细胞裂解物按照A中的IP进行处理，随后对内源性Rab8（α-Rab8）或GFP标记的Rab8进行IB处理（α-GFP）。WT和DN Rab1或8的裂解物显示在每个印迹的前两条车道上（每条车道装载5μg）。这些数据证实了KCa3.1与Rabs1和Rabs8之间的关联。数据代表了3个实验。
图6
图6。DN Rab1和Rab8减缓了KCa3.1的ER/Glgi-to-lasma膜传递。
A类.关于质膜BLAP-KCa3.1阻断方案的IF图解，以及随后沿着生物合成途径在质膜上出现的新BLAP-KSa3.1。在pBudCE中用BLAP-KCa3.1和BirA-KDEL转染HEK293细胞4.1使BLAP-KCa3.1在ER水平上特异性生物素化的质粒（见方法）。顶行：质膜BLAP-KCa3.1标记有链霉亲和素-Alexa488（左侧；绿色），随后标记有链霉菌亲和素-Alexa555（中间；红色）。显而易见，strep-488饱和了生物素结合位点，排除了strep-555标记；显示了对现有质膜定位的KCa3.1通道的阻断。中间一行：在19°C下2小时在高尔基体内积累KCa3.1后，一些最初标记在质膜上的通道（strep-488）被内吞。用strep-555标记表明，在这19°C的孵育过程中，没有新的通道像预期的那样进入质膜。最下面一行：在37°C下进一步培养80分钟会导致KCa3.1通道在T = 0.用链球菌-555标记表明，新的KCa3.1通道出现在质膜上，与高尔基体外的转运相一致。Nuclei标有DAPI（蓝色）。B类除了使用中微子素阻断现有的质膜KCa3.1外，实验如A所示进行。如第2栏中的每个印迹所示，由于链霉亲和素与质膜BLAP-KCa3.1结合，中微子亲和素消除了90%以上的标记。在37°C下孵育10分钟内，KCa3.1开始出现在内质网/高尔基体退出后的质膜上。2小时后，KCa3.1相对于T恢复了约50% = 在存在WT Rab1和Rab8的情况下为0，而在存在DN Rab1或Rab8时降至～27%。每条车道装载30μg蛋白质。3个实验的平均值显示在条形图中。实心条表示存在WT-Rab时KCa3.1的表达，而开放条表示存在DN-Rab时的KCa3.1表达（与WT-Rab相同时间段相比，*P<0.05）。“<”表示非特定带。这些结果表明，DN Rab1和Rab8减缓了KCa3.1从ER/高尔基体的排出，导致质膜表达降低，如图所示。4。
图7
图7。DN Rab1和Rab8降低极化上皮细胞KCa3.1的质膜表达。
A类.BLAP-KCa3.1和WT或DN Flag-Rab1（N124I）（顶行）或GFP-Rab8（T22N）（底行）转染到融合的MDCK细胞中。用链霉亲和素Alexa555（红色）标记质膜KCa3.1，然后固定/渗透细胞，用α-标记抗体标记Rab1（Rab8标记GFP）。DN Rab1（顶部面板）和Rab8（底部面板）均导致质膜KCa3.1表达明显减少。Nuclei标有DAPI（蓝色）。B类BLAP-KCa3.1和WT或DN Flag-Rab1（N124I）或GFP-Rab8（T22N）转染到MDCK（左）或FRT（右）细胞和IB评估的质膜KCa3.1中（见方法）。根据我们的HEK298数据，将WT和DN Rab2与BLAP-KCa3.1作为阴性对照转染到MDCK细胞中（图4）。每条车道装载10μg蛋白质。Tubulin被用作负荷控制。IB分别使用α-标记和α-GFP抗体确认Rab1和Rab8的表达。C类3个单独印迹的定量表明，DN Rabs1和8降低了MDCK和FRT细胞中KCa3.1的质膜表达（相对于WT Rabs，*P<0.05），而DN Rab2对MDCK细胞中KCa3.1的膜表达没有影响。
图8
图8。KCa3.1的基底外侧靶向性与衔接蛋白μ1B无关。
A类.BLAP-KCa3.1转导至WT LLC-PK1单元格（左侧面板）或LLC-PK1稳定表达μ1B（右面板）的细胞在Transwell®过滤器上生长汇合。使用重组BirA和生物素化蛋白对AP和BL膜进行生物素化，并用链霉亲和素Alexa555（红色）标记生物素化蛋白质。顶端膜与WGA-Alexa488（绿色）共同标记。用DAPI（蓝色）标记细胞核。顶部面板显示通过细胞中间平面的单个共焦截面，底部面板显示z堆叠。KCa3.1仅在LLC-PK的BL中检测到1克隆。B类.WT LLC-PK的AP或BL膜1单元格（左侧面板）或LLC-PK1使用BirA对生长在Transwell®过滤器上并融合的稳定表达μ1B（右面板）的细胞进行生物素化，然后进行链霉亲和素标记和随后的IB，以确定KCa3.1的定位。KCa3.1在两个LLC-PK1克隆中都特异定位于BL膜。Tubulin被用作负荷控制。印迹是3个独立实验的代表。每条车道装载20μg蛋白质。C类.IB确认LLC-PK中Flag-tagedμ1B的表达1-μ1B细胞系。
图9
图9。KCa3.1不通过转铁蛋白阳性再循环内体进入MDCK细胞的质膜。
用转铁蛋白受体（TfnR）和BirA-KDEL/BLAP-KCa3.1转导MDCK细胞，然后TfnR-与Tfn-Alexa488（绿色）和Tfn-HRP的混合物结合，并在37℃下内吞40分钟。然后用链霉亲和素Alexa555（红色）标记质膜BLAP-KCa3.1。这显示在左侧面板（T = 0），并确认在这些条件下，我们能够标记融合MDCK细胞中的TfnR和KCa3.1。为了确定KCa3.1是否通过TfnR阳性再循环内体进入质膜，我们如上所述标记了Tfn R，并用中性黄素阻断质膜BLAP-KCa3.1。随后，通过Tfn-HRP与H反应进行再循环内体消融2O（运行）2+DAB（DAB被省略为非消融控制）和ER/Galgi出口允许在37°C下继续运行2小时，然后将新输送至质膜的KCa3.1标记为strep-555（更多详细信息，请参阅方法和结果部分）。如T所示 = 0面板和无DAB对照（右上面板），Tfn-488在整个细胞质的内胚体中表达，正如预期的那样，它会再循环到质膜。然而，DAB依赖性消融后，Tfn-488聚集在再循环内体中，其核周定位证明了这一点；证实再循环内体消融导致TfnR转运回质膜受到抑制。重要的是，在消融细胞和非消融细胞中，BLAP-KCa3.1通过质膜，这表明KCa3.1在通往质膜的过程中不会通过TfnR-阳性再循环内体。图像代表了3个单独的实验。
图10
图10。KCa3.1不通过RME-1阳性再循环内体进入质膜。
A类MDCK细胞转染BLAP-KCa3.1和GFP标记的WT（顶部面板）或DN（底部面板）RME-1。质膜定位的KCa3.1可以用链霉亲和素Alexa555（T = 0）生物素化后，这可以通过预先用中性粒细胞生成素（Block）来阻止。在质膜（block+19°C）上未检测到19°C BLAP-KCa3.1下的阻滞和ER/Golgi陷阱。随后在37°C下培养2小时，在WT-和DN-RME-1-表达的MDCK细胞的质膜上均出现BLAP-KCa3.1。B类A中的实验由IB定量。显然，在20分钟和2小时时，KCa3.1在质膜上的出现率不会因DN RME-1的表达而改变。每个泳道加载10μg蛋白质。IB使用α-GFP抗体证实了WT和DN RME-1的表达C类填充条表示在WT RME-1存在时KCa3.1的表达（*T方面P<0.05 = 0），而开条表示存在DN RME-1时KCa3.1的表达（#P<0.05关于T = 0）（n =  3). KCa3.1质膜出现率无差异，表明KCa3.1在到达质膜的过程中不会通过RME-1阳性再循环内体。D类用TfnR转导MDCK细胞，并转染GFP标记的WT（顶部面板）和DN（底部面板）RME-1。TfnR与Tfn-Alexa546结合，并在37°C下内吞45分钟，然后固定/渗透细胞（见方法）。在存在WT RME-1的情况下，Tfn-546均匀分布在细胞质中，而在存在DN RME-1时，Tfn-546被困在核周隔室中。注意，在不表达DN RME-1的细胞中，Tfn-546定位于细胞质中，与观察到的WT RME-1表达类似。这些结果表明，与KCa3.1相比，TfnR通过RME-1阳性再循环内体进行转运。
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