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.2014年4月25日;289(17):11986-11992.
doi:10.1074/jbc。M114.557694。 Epub 2014年3月13日。

抗病毒蛋白干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)的磷酸化双重调节其内吞和泛素化

附属公司

抗病毒蛋白干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)的磷酸化双重调节其内吞和泛素化

尼古拉斯·M·切萨里诺等。 生物化学杂志. .

摘要

干扰素诱导型跨膜蛋白3(IFITM3)对小鼠和人类抵抗流感病毒的先天防御至关重要。IFITM3定位于防止病毒融合的内溶酶体,尽管控制其向该细胞室的转运的机制尚不完全清楚。我们确定小鼠和人类IFITM3都被酪氨酸20(Tyr(20))上的蛋白酪氨酸激酶FYN磷酸化,并且小鼠IFITM3s也在非服务的Tyr上磷酸化(27)。磷酸化导致IFITM3的细胞重新分布,包括质膜积聚。Tyr(20)突变导致了IFITM3的类似再分配,并导致抗流感病毒的抗病毒活性降低,而小鼠IFITM2的Ty(27)突变对定位或活性的影响最小。使用FYN敲除细胞,我们还发现IFITM3磷酸化不是其抗病毒活性的必要条件。总之,这些结果表明Tyr(20)是内吞信号的一部分,可被磷酸化或该残基的突变阻断。进一步的突变将该内吞控制区缩小为四个残基,符合YXXΦ(其中X是任何氨基酸,Φ是Val、Leu或Ile)内吞基序,当转移到CD4时,导致其从细胞表面内化。此外,我们发现FYN对IFITM3的磷酸化和Tyr(20)的突变都导致IFITM3-泛素化降低。总的来说,这些结果表明,Tyr(20)的修饰可能在控制IFITM3贩运和降解的细胞检查点中起作用,并证明了IFITM3.翻译后调控的复杂性。

关键词:细胞内吞;IFITM;IFITM3;流感病毒;先天免疫;干扰素;磷酸化;磷酸酪氨酸;翻译后修饰;无所不在。

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数字

图1。
图1。
FYN的IFITM3磷酸化。 A类,hIFITM3和mIFITM3-氨基酸15–30的比对。酪氨酸突出显示为灰色阴影。B类C类,SYF细胞与指示的myc标记的hIFITM3共转染过夜(B类)或mIFITM3(C类)构建载体控制或表达FYN的质粒。然后用原钒酸钠处理细胞1小时。对细胞裂解物进行抗FYN和抗肌动蛋白免疫印迹或抗myc免疫沉淀(IP(IP))然后用印迹法检测抗磷酸酪氨酸(对-Tyr)和抗myc。印迹是至少三个实验的代表。
图2。
图2。
IFITM3在没有FYN的情况下有效。 A类B类,用对照siRNA转染SYF细胞18 h(siCont公司)或siRNA靶向IFITM3(siIFITM3型).A类,在感染前收集细胞,通过抗IFITM3 Western blotting确认IFITM3。抗-GAPDH印迹用作加载控制。B类siRNA处理后,将细胞感染流感病毒株PR8,感染倍数为5,持续24小时。然后固定细胞并用抗流感核蛋白染色,以使用流式细胞术测量感染细胞的百分比。显示的结果是来自两个独立实验的六个样本的平均值。为了计算相对感染倍数,siCont细胞的平均感染百分比设置为1。误差线代表平均值±S.D.学生t吨测试用于计算指示的第页值。
图3。
图3。
IFITM3的Tyr-20是对抗流感病毒的完全抗病毒活性所必需的。 A类B类,用指示的myc标记的IFITM3构建物或载体对照物转染HEK293T细胞过夜,用感染倍数为2.5的流感病毒株PR8感染6小时。然后固定细胞并用抗myc和抗流感核蛋白染色,以确认IFITM3的表达,并使用流式细胞仪分别测量感染细胞的百分比。A类,在载体对照中缺乏染色的基础上对myc阳性细胞进行门控,并以直方图形式进行分析,以确认IFITM3和酪氨酸突变体的可比表达。B类,myc阳性细胞按A类以未感染样本为门控基线,在抗流感核蛋白染色的基础上分析感染率。显示的结果是来自至少三个独立实验的至少九个样本的平均值。表达WT-mIFITM3的细胞的平均感染率设置为1,用于计算相对感染倍数。误差线表示平均值±S.D.结果显示在日志上2便于观察WT IFITM3和酪氨酸突变体之间差异的量表。学生的t吨测试用于计算指示的第页值。
图4。
图4。
IFITM3 Tyr-20磷酸化或突变影响IFITM2定位,包括质膜积累。 A类B类,SYF细胞与指示的myc标记的hIFITM3共转染(A类)或mIFITM3(B类)构建载体控制或表达FYN的质粒。用于核染色的代表性合并荧光共聚焦显微镜图像(DAPI,蓝色)和抗myc染色(红色)如图所示。插图描绘抗FYN染色(灰度)在某些条件下显示,以确认FYN表达或缺乏FYN。
图5。
图5。
Y的标识XX年IFITM3中的Φ内吞基序。 A类hIFITM3和mIFITM315–30氨基酸的比对。酪氨酸突出显示为灰色阴影和守恒YXX年Φmotif已标记并下划线的。B类,用指示的myc标记的hIFITM3构建物转染SYF细胞过夜。核染色(DAPI,蓝色)和抗myc染色(红色)如图所示。
图6。
图6。
来自hIFITM3的YEML基序导致CD4的内化。 A类B类,小鼠胚胎成纤维细胞用myc标记的CD4或CD4-YEML构建体转染过夜。A类用抗CD4抗体对未渗透或渗透的细胞进行荧光共聚焦显微镜染色。核染色的代表性合并图像(DAPI,蓝色)和抗CD4染色(绿色)如图所示。B类用抗myc抗体对渗透细胞进行共聚焦荧光显微镜染色。用于核染色的代表性合并图像(DAPI,蓝色)和抗myc染色(红色)如图所示。
图7。
图7。
未修饰的Tyr-20是IFITM3泛素化所必需的。 A类293T细胞与指示的myc标记的IFITM3构建物和表达FYN的载体对照或质粒共转染过夜。进行抗-myc和抗-fyn印迹。B类,293T细胞转染指示的myc标记的IFITM3构建物过夜,并进行抗myc印迹。A类B类,过度暴露抗myc印迹,以显示泛素化IFITM3。单箭头双头箭头分别表示单泛素化和双泛素化IFITM3。预期分子质量为15 kDa的IFITM3用作负载控制。C类293T细胞与指定的HA标记的IFITM3构建物和表达FLAG标记泛素的质粒共转染过夜(Ub(英国)). 进行抗-HA免疫沉淀,然后进行抗HA和抗FLAG印迹。中的结果A–C至少有三个实验具有代表性。

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