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.2014年3月14日：5:3436。
doi:10.1038/ncomms4436。

内皮细胞的自我识别使调节性T细胞贩运成为可能，并定义了免疫调节的动力学

傅红梅 1, 马达夫·基肖尔 1, Beartie Gittens公司 1, 王国苏 1, 大卫·科 1, 伊莎贝拉·科马罗夫斯卡 1, 埃尔维拉因凡特 2, 安妮·雷德利 2, 戴安·库珀 1, 毛罗·佩雷蒂 1, 费德里卡·马雷利·伯格 1
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内皮细胞的自我识别使调节性T细胞贩运成为可能，并定义了免疫调节的动力学

傅红梅等。 国家公社. .
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摘要

CD4（+）CD25（+）Foxp3（+）调节性T（Treg）细胞定位于淋巴组织和非淋巴组织有助于有效控制免疫反应。与传统T细胞相比，Treg细胞在T细胞库中只占很小的一部分。尽管在数量上存在缺陷，Tregs仍能有效迁移到免疫反应部位，达到调节T效应细胞（Teff）的最佳数量。Tregs粘附和趋化因子受体表达的排列和水平并不能解释其强大的迁移能力。在这里，我们表明，识别目标组织中内皮细胞表达的自身抗原有助于在体内有效招募Treg。这一事件依赖于IFN-γ介导的内皮细胞对MHC-II类分子表达的诱导，并需要T细胞受体对PI3K p110δ的最佳激活。我们还表明，一旦进入组织，Tregs就会抑制Teff的补充，从而使Teff:Treg比率达到最佳调节效果。

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数字

图1
图1。抗原识别有助于Treg贩运。
FoxP3-eGFP报告小鼠的CD4+T细胞总数（107/小鼠）静脉注射到同基因C57BL/6或无关的CBA（H2k个)腹腔注射600只小鼠 U IFN-γ72 提前h。一些C57BL/6受体仅接受盐水。GFP的存在+用流式细胞术16分析洗液、dLN和脾脏中的Tregs 小时后。通过CD4上的门控来识别Tregs+GFP公司+人口。面板中显示了代表性的点图一Treg细胞的平均数量（在CD4总量中+图中显示了在腹膜腔和淋巴器官中检测到的Treg细胞数量b条。误差条代表标准差。使用未配对学生的t吨-测试。(n个=3,N个=4）**P（P）<0.01。(c（c）)GFP公司+用抗CD69-PE/Cy7（克隆H1.2F3）对IFN-γ治疗的同基因C57BL/6受体在相同部位检索到的Tregs进行染色。流式细胞术分析CD69的表达。虚线显示用同种型匹配的对照抗体进行的非特异性染色。直方图代表了三种细胞制剂。
图2
图2。异基因Tregs更有效地迁移到异基因小鼠的腹腔。
同种异体Tregs（H2b条)由扩展在体外BALB/c-衍生培养，（H2d日)未成熟DC和IL-2。关键表型标记在面板中描述一（CD25和FoxP3）和b条（CCR7和CD62L）。面板内c（c）在C57BL/6常规原始T细胞（105)用BALB/c-衍生DC刺激（10三)或CD3/CD28珠。T细胞增殖测定如下三HTdR在三份培养物中的掺入(N个=5). 误差条代表标准差。统计显著性是用未配对学生的t吨-测试*P（P）<0.05, **P（P）<0.01。面板d日,e（电子）：CFSE标记的H2d日-静脉注射同种异体Treg细胞（107/小鼠）转化为同种抗原BALB/c、同基因C57BL/6或无关的CBA（H2k个)腹腔注射600只小鼠 U IFN-γ72 提前h。GFP的存在+用流式细胞术16分析灌洗液、肠系膜dLN、非dLN和脾脏中的Tregs 小时后。面板中显示了代表性的点图d日Treg细胞的平均数量（在CD4总量中+在腹膜腔和淋巴器官中检测到e（电子）。误差条代表标准差。使用未配对学生的t吨-测试。(n个=3,N个=4) *P（P）<0.05, **P（P）<0.01.
图3
图3。自我认可推动Treg招聘。
CD4总量+GFP-Foxp3 Marilyn F1小鼠的T细胞（107/小鼠）静脉注射到接受了600 U IFN-γ72 提前h。使用抗Vβ6抗体鉴定Marilyn T细胞。GFP的存在+Vβ6+用流式细胞术16分析洗液、dLN和脾脏中的Tregs 小时后。通过CD4上的门控来识别Tregs+T细胞群。面板中显示了代表性的点图一Treg细胞的平均数量（在CD4总量中+图中显示了在腹膜腔和淋巴器官中检测到的Treg细胞数量b条。误差条代表标准差。使用未配对学生的t吨-测试。(n个=3,N个=2) *P（P）<0.05.
图4
图4。Treg的积累需要靶组织表达MHC II类分子。
CD4总量+将从FoxP3-GFP报告小鼠分离的T细胞静脉注射到同基因C57BL/6小鼠（107/小鼠）腹腔注射600 U IFN-γ72 提前h。在Treg过继移植之前，受体小鼠接受了500只 μg抗MHC II类抗体（克隆M5/114，BioXCell）或同种对照抗体。GFP的存在+用流式细胞术16分析腹腔灌洗液、dLN、ndLN和脾脏中的Tregs 小时后。通过CD4上的门控来识别Tregs+GFP公司+人口。面板中显示了代表性的点图一Treg细胞的平均数量（在CD4总量中+在腹膜腔和淋巴器官中检测到b条.误差条表示s.d.用未配对的学生的统计显著性进行计算t吨-测试。(n个=3,N个=3) *P（P）<0.05.
图5
图5。TNF-α不会增强Tregs向靶组织的募集。
CD4总量+FoxP3-GFP报告小鼠的T细胞（107/小鼠）静脉注射到腹腔注射20 ng TNF-α（Peprotech）或对照盐水48 提前h。GFP的存在+用流式细胞术分析洗液、dLN、ndLN和脾脏中的Tregs。面板中显示了代表性的点图一Treg细胞的平均数量（在CD4总量中+图中显示了腹膜灌洗和淋巴器官b条CD68染色分析灌洗液、dLN、ndLN和脾脏中内源性单核细胞的募集。面板中显示了至少三名受体的腹膜腔和淋巴器官中检测到的单核细胞的平均数量c（c）。误差条代表标准差。使用未配对学生的t吨-测试。(n个=3,N个=4) *P（P）<0.05.
图6
图6。Treg的积累需要靶组织对IFN-γ刺激的反应性。
(一,b条)CD4总量+IFN-γ受体KO小鼠的T细胞（107/老鼠）被标记为2 μM PKH26并静脉注射到同基因WT C57BL/6或无关的CBA（H2k个)腹腔注射600只小鼠 U IFN-γ72 提前h。PKH26的存在+，CD4+CD25细胞+用流式细胞仪16分析腹腔灌洗液和dLN中的Tregs 小时后。面板内一，显示了在腹腔灌洗液和dLN中检测到的IFN-γR KO Treg细胞的代表性点图。Treg细胞的平均数量（在总CD4中+图中显示了腹膜腔和dLNb条。误差条代表标准差。使用未配对学生的t吨-测试。(n个=3,N个=4）*P（P）<0.05. (c（c）,d日)FoxP3-GFP报告小鼠的CD4 T细胞总数（107/小鼠）静脉注射到腹腔注射600 U干扰素-γ72 提前h。PKH26的存在+，CD4+CD25细胞+用流式细胞术16分析腹腔灌洗液和dLN中的Tregs 小时后。Tregs通过CD4进行门控+GFP公司+人口。面板中显示了代表性的点图c（c）Treg细胞的平均数量（在CD4总量中+图中显示了腹膜腔和dLNd日。误差条代表标准差。使用未配对学生的t吨-测试。(n个=3,N个=2) *P（P）<0.05. GFP对CXCR3和CCR7的表达+流式细胞术分析Treg细胞(e（电子）)以及它们对各自配体CXCL10（300）的迁移反应 天然气 毫升−1)和CCL19/21（200 天然气 毫升−1)通过6小时跨孔分析（106/井）(（f）). 数据代表三个相同设计的独立实验。误差条代表标准差。统计显著性是用未配对学生的t吨-测试*P（P）<0.05, ***P（P）<0.001.
图7
图7。Treg向非淋巴组织募集是由血管内皮的同源识别引起的。
(一)从接受600个剂量的C57BL/6小鼠的腹膜、dLN和ndLN U IFN-γ或对照盐水i.p.72 h前用抗CD31（绿色荧光）和抗MHC II单克隆抗体（红色荧光）染色，并用宽场荧光显微镜进行分析。Nuclei以DAPI（蓝色）高亮显示。比例尺，10 微米。(b条)新分离的GFP-Tregs（106/well）接种到IFN-γ或盐处理的同基因B6或生长在转座上的无关CBA-EC单层上。在6点测得的平均迁移百分比 给出了三个相同设计的实验的h*P（P）<0.05. (c（c）)为了防止抗原递呈，一些经IFN-γ处理的EC单层在37℃时暴露于抗MHC II类抗体（克隆M5/114，BioXcell） 30°C 在接种T细胞之前的分钟**P（P）<0.01。(d日)在6点测得的平均迁移百分比 给出了三个相同设计的实验的h。误差条表示s.d*P（P）<0.05. (d日)氢气d日异种Tregs扩增在体外（5×105/well）接种到IFN-γ处理的异基因BALB/c、同基因B6和在跨well上生长的无关CBA-EC单层上。在6点测得的平均迁移百分比 给出了三个相同设计的实验的h。误差线代表s.d**P（P）<0.01。(e（电子）–我)异基因男性BALB/C和CBA/Ca（H2d日，氢气k个)小鼠接受阴囊内注射IFN-γ（1200 400中的U μl生理盐水）。72岁之后 h、 在提睾肌外科外化后，静脉注射荧光标记（CFSE）Treg细胞，通过静脉显微镜观察并量化T细胞与小静脉壁的相互作用 最小值(e（电子）)滚动。(（f）)速度。(克)牢固的附着力。(小时)外渗。荧光显微镜下观察到的克雷马斯特肌切片显示，BALB/c小鼠组织中的T细胞大量涌入，而对照CBA小鼠没有(我). 细胞核用DAPI染色（蓝色）。结果来自每组6只小鼠，H2d日与H2相比k个小鼠品种用星号表示。误差线代表s.d*P（P）<0.05 (N个=2). 比例尺，10 微米。在上述所有实验中，使用未配对学生的t吨-测试。
图8
图8。PI3K p110δ活性是抗原驱动的Treg募集所必需的。
(一)氢气d日-用5 μM IC87114或带车辆控制30 在室温下保持最小值，然后在使用前清洗。车辆控制处理（填充符号）和抑制剂处理（开放符号）T细胞（5×105/well）接种到异基因BALB/c和不相关的CBA小鼠衍生的IFN-γ处理的EC单层上。6岁时测量的T细胞迁移 图中显示了h。数据代表了至少三个相同设计的独立实验。误差条代表标准差。统计显著性是用未配对学生的t吨-测试*P（P）<0.05. (b条)BALB/c-特异性Tregs用5 μM IC87114或带车辆控制30 在室温下保持最小值，然后在使用前清洗。BALB/c和CBA小鼠腹腔注射600 U IFN-γ。72岁之后 h、 CFSE标记的车用Tregs和DDAO SE标记的抑制剂处理的Tregs（107/小鼠）共同静脉注射。24小时后，分析腹腔内标记的T细胞和dLNs的存在 流式细胞术检测h。Treg细胞的平均数量（在CD4总量中+图中显示了腹膜腔中检测到的dLNsc（c）。误差条代表标准差。使用未配对学生的t吨-测试。(n个=3,N个=3) *P（P）<0.05.
图9
图9。Treg细胞抑制启动的常规T细胞向靶组织的募集。
(一)氢气d日-将同种特异性Treg或常规T细胞接种到融合的CBA衍生EC单层上，并用IFN-γ（300 单位 毫升−1)用于72 h.通过时间扫描显微镜监测T细胞迁移。爬行速度（μm 最小值−1)使用ImageJ分析软件测量T细胞的数量。在每个实验条件下，追踪大约30-40个细胞。误差条代表标准差。统计显著性是用未配对学生的t吨-测试。N个=2. (b条,c（c）)氢气d日-同种异体常规T细胞（107/老鼠）被标记为1 μM DDAO SE并与CFSE标记的H2共同静脉注射d日-同种异体Tregs（107/小鼠）腹腔注射600只BALB/C小鼠 U干扰素-γ72 提前h。DDAO SE的存在+Teff/cm和钢管混凝土+对腹腔、dLN、ndLN和脾脏中的Tregs进行了分析16 h后流式细胞仪检测。典型点图和腹腔灌洗中标记细胞的平均数量如图所示b条和c（c）分别是。误差条代表标准差。统计显著性是用未配对学生的t吨-测试*P（P）<0.05 (n个=3,N个=2).
图10
图10。干扰素-γ-内皮诱导的MHC表达协调淋巴组织和非淋巴组织中的效应器和调节反应。
幼稚T细胞在LN中被激活，分化为T效应器（Teff）和T中枢记忆（Tcm）并产生IFN-γ（1）。IFN-γ通过内皮细胞诱导MHC II类：自体肽复合物的表达，这被Tregs识别（2）。这一事件增强了Tregs向LN的募集，在LN中Tregs自身被激活，随后抑制T细胞的扩张、分化和Tcm细胞的募集（3）。Teff细胞迁移到富含抗原的外周组织，在那里它们被重新激活并产生IFN-γ（4）。由于内皮细胞诱导MHC II类：自体肽复合物表达，Treg细胞被招募到非淋巴靶组织（5）。一旦进入组织，Tregs就会抑制效应器反应（组织损伤，由濒死的灰细胞指示），并进一步将Teff招募到组织中（6）。
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