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.2014年3月25日；111(12):4484-9.
doi:10.1073/pnas.1319738111。 Epub 2014年3月12日。

原始人类胚胎干细胞的衍生

卡罗尔·B·瓦尔 1, 安吉丽克·尼尔森（Angelique M Nelson）, 布里格姆·麦卡姆, 詹妮弗·赫森, 周文宇, 艾丽卡·C·琼林, 安东尼奥·吉梅内斯·卡利亚尼, 邓新宪, 克里斯托弗·卡瓦诺, 萨凡纳厨师, 保罗·J·特萨, 杰弗里·奥卡达, 莉莉亚娜·玛格丽塔, 亨利克·斯珀伯, 迈克尔·崔, C安东尼·布劳, Piper M Treuting公司, R大卫·霍金斯, 文森佐·齐鲁利, 汉内尔·鲁霍拉·巴克
附属公司

原始人类胚胎干细胞的衍生

卡罗尔·B·威尔等。 美国国家科学院程序. .

摘要

小鼠幼稚的多潜能状态已被证明相对于启动的小鼠外胚层细胞具有更广泛和更强大的发育潜力。人类幼稚ES细胞状态在不使用转基因的情况下避免了衍生，OCT4、KLF4和KLF2的强制表达允许人类细胞保持幼稚状态[Hanna J等人（2010）美国国家科学院院刊107（20）：9222-9227]。我们描述了两种生成非转基因原始人类ES细胞（hESCs）的途径。第一种方法是通过在组蛋白脱乙酰酶抑制剂丁酸盐和亚甲酰苯胺羟肟酸中预培养，然后在MEK/ERK和GSK3抑制剂（2i）中用FGF2培养，反向切换预先存在的已启动hESC系。第二种方法是直接从2i的人类胚胎中衍生FGF2。我们通过生长特征、抗体标记谱、基因表达、X灭活谱、线粒体形态、microRNA谱和畸胎瘤的发育，证明人类幼稚细胞符合小鼠幼稚状态的标准。人胚胎干细胞可以在不需要转基因的情况下以幼稚状态存在。直接衍生是一个难以捉摸但可以实现的过程，导致细胞处于人类体外多能性的最早期阶段。将启动的细胞反向切换至初始状态是有效且可重复的。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
2i培养对小鼠和人多能干细胞的影响。(A类)小鼠多能性菌落碱性磷酸酶染色。左侧两个平板：添加到mEpiSC菌落中的2i会导致碱性磷酸酶阳性细胞的分化和丢失。右四个平板：在添加2i之前，在丁酸盐和SAHA中培养的mEpiSCs至少传代1次，使多能性菌落繁荣。(B类)hESC（H1）在Matrigel上通过丁酸盐向后切换到2i，或在2i培养前未暴露于B/S时向前切换到分化，表明2i必须跟随B/S暴露以防止分化。（比例尺，100μM。）
图2。
图2。
幼稚hESCs的基因组分析。(A类)H1-2iF细胞中HIF2α（EPAS1）靶基因相对于亲本H1的RNA表达热图[H1p58（B/ST2）2iF14 vs.TeSR2中H1p58；一式四份]。(B类)主成分分析比较小鼠全基因组安捷伦阵列数据比较Hunter等人（8）胚胎数据(左侧)与mESC等价物：R1p22（mESC-2iL，naive）、mEpiSC7p24AF（mEpiSC AF，primed）和mEpiSC7p55（AF7，B/S1）2iL20(赖特). Elf1幼稚（3iL，绿色方块）和引物（AF，蓝色方块）表达数据与左侧绘图中的活体小鼠胚胎数据进行了比较。(C类)比较内部Elf1表达阵列数据，作为测量内部（UW）数据的标准（H1-2iF×四次重复；引物：H1×四次反复）和Hanna等人（5）生成的数据。天真：C1.1、C1.2、WIBR3.1、WIBR3.3、WIBR3.5；primed：第一组-BG01，BG01-mTeSR；BG01-NANOGtgk；第二组——WIBR1、WIBR2、WIBR3rep1、WIBRE3rep2和WIBR3–5%O2注意，与原始Elf1进行比较的左侧测试线在图的Elf1素数侧分组相同。假定的幼稚细胞系由深蓝色圆点表示，假定的引物为橙色。(D类)Elf1（底线黑色）和H1（上面的蓝色线）POU5F1增强子区域的DNase I超敏反应分析。POU5F1的第一个外显子显示在H1数据的上方，并带有一个2-kb大小的条带，以映射近端增强子（PE）和远端增强器（DE）。(E类)ChIP-seq H3K27me3比较引物人胚胎干细胞【橙色系，数据取自Gafni等人（6）】与原始Elf1-2iL（蓝色系），使用C类与基因Ontogeny“发育基因”相交(n个= 648).
图3。
图3。
人胚胎干细胞多能性阶段分析。(A类)与多能性相关的MicroRNA分析。(B类)XIST标记显示Elf1-3iLs(左侧)FISH不显示XIST云，而Elf1启动后有两个XIST信号，细胞分化10天(赖特)在细胞核内获得单个XIST信号（红点）。当使用DAPI高亮显示细胞核时，在幼稚的Elf1中无法检测到场放大的XIST(左下方)而XIST信号可以在一条或两条X染色体上分化时检测到（红点、白箭头、，右下角两个面板）。(C类)使用11L-11R引物对XIST启动子进行亚硫酸氢盐测序表明，XIST在幼稚期和引物期始终保持甲基化。使用7L-7R引物，甲基化似乎在幼稚细胞中相对于引物细胞减少，在玻璃体分化细胞和98-d畸胎瘤中减少10-d。注意，1、9和11引物组与组11分化后的数据没有差异。开口圆圈表示未甲基化，填充圆圈表示甲基化CpG。(D类)代表Elf1幼稚（绿色）、Elf1引物（黄色）、H1幼稚（深蓝色）和H1引物（浅蓝色）的克隆效率（百分比）和倍增时间（小时）的图。(E类)线粒体的电子显微镜。左侧面板显示了Elf1-3iL和Elf1-AF之间的线粒体形状差异。这在右侧的图表中进行了量化，其中增加的比率表示线粒体种群更圆（±SEM）***P（P）< 0.001, **P（P）<0.01，以及*P（P）<0.05，根据t吨测试。
图4。
图4。
由幼稚细胞、幼稚-启动细胞和启动-启动细胞产生的畸胎瘤反映了广泛的内胚层发育能力。(A类)Elf1p17-2iL10（幼稚；42 d）和Elf1p15T8（引物，67 d）畸胎瘤的H&E标记切片。(B类)Elf1畸胎瘤切片的内皮特异性标记A类两个肿瘤的上部两个面板是连续切片，上部标记为突出肝脏发育（红色，白蛋白；绿色，α-甲胎蛋白；蓝色，E-钙粘蛋白），第二组标记为突出胰腺发展（红色，PDX1；绿色，SOX9；蓝色，E-钙粘素）。两种肿瘤的下三个面板（降序）也代表不同的连续切片，第一组代表肝脏发育，第二组代表胰腺发育，第三组代表替代标记物的肝脏发育（标记如上和红色，CYP3A和绿色，HNF4A）。下部Elf1p17-2iL10原始面板用于加强对这些肿瘤内胚层发育组织水平的印象（红色，FOXA2；绿色，SOX9；蓝色，E-cadherin），右下面板（Elf1p15T8）为阴性对照。(C类)H1幼稚、44-d畸胎瘤的H&E切片。H&E切片下方的图表表示启动后（H1p44-AF9）、初始[H1p49（B/S3）2iF10]和初始恢复为启动后[H1p49[B/S3，2iF4）AF5]H1生成的畸胎瘤中E-cadherin（上皮细胞）或PDX1（胰腺祖细胞）染色区域的定量，表明在幼稚状态下，相对于启动状态，总上皮发育潜能和胰腺亚群均增强。(D类)前三个面板是mESC畸胎瘤的H&E切片（幼稚，13天）。下面的面板显示了mESC畸胎瘤切片的免疫荧光标记。（比例尺英寸A类和D类，100μM；它们定义了所有H&E染色部分的比例。）
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