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.2014年4月；42(8):4947-61.
doi:10.1093/nar/gku151。 Epub 2014年3月11日。

苏德霉素E影响选择性剪接并改变染色质修饰

保罗·卡夫蒂尼 1, 沈曼丽, 菲利普·波特, 古斯塔沃·帕拉西奥斯, 钱德莱亚·拉吉塞蒂, 皮埃尔·德拉格兰奇, 克雷格·霍宾斯基, Yvonne N Fondufe-Mittendorf公司, 托马斯·韦伯, 斯特凡·斯坦姆
附属公司

苏丹霉素E影响选择性剪接并改变染色质修饰

保罗·卡夫蒂尼等。 核酸研究. 2014年4月.

摘要

Sudemycin E是信使前RNA剪接调节剂FR901464及其衍生物剪接抑素A的类似物。我们发现，与拼接抑素A类似，苏丹霉素E与U2小核核糖核蛋白（snRNP）组分SF3B1结合。天然染色质免疫沉淀显示U2 snRNPs与核小体发生物理相互作用。苏丹霉素E诱导U2 snRNP解离并减少其与核小体的相互作用。为了确定对基因表达的影响，我们进行了全基因组阵列分析。苏德霉素E首先导致替代信使前RNA剪接的快速变化，随后是整体基因表达的变化和细胞周期G2期的停滞。替代外显子用法的变化与编码这些外显子的染色质中H3K36me3修饰的缺失相关。我们认为苏丹霉素E干扰U2 snRNP在活性转录基因中维持H3K36me3修饰的能力。因此，除了选择性剪接的可逆变化外，苏丹霉素E还引起染色质修饰的变化，导致染色质浓缩，这可能是导致癌细胞死亡的一个因素。

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数字

图1。
图1。
苏丹霉素E与SF3B1结合，对癌细胞株有毒。(A类)苏丹霉素E（左）及其生物素化衍生物（右）的结构。(B类)生物素化苏丹霉素与SF3B1的结合。生物素化苏丹霉素与链霉亲和素结合，再与HeLa核提取物孵育，然后用PBS洗涤。结合的SF3B用1%SDS、10mM Tris和SF3B1煮沸洗脱，western blot检测。五十： 装载，W：清洗，B：结合苏丹霉素。负载对应于总输入。加载了10%的输入。(C类)采用MTT法测定Rh18、HEK293、HeLa和原代成纤维细胞的IC50；n个= 4. 苏德E：苏德霉素E。
图2。
图2。
短时间使用苏丹霉素E足以导致细胞死亡。(A类)1µM苏丹霉素存在下Rh18细胞的存活；0时加入苏丹霉素，MTT法测定细胞活力，n=4；箭头表示冲洗时间。(B类)用1µM苏丹霉素孵育30分钟后，Rh18细胞存活，然后通过改变培养基冲洗掉药物。用MTT法测定细胞活力，n个= 4. (C类)苏丹霉素在细胞培养基中的稳定性。在细胞培养基中培养一个微摩尔苏丹霉素，乙腈萃取后用质谱法测定苏丹霉素E的含量。(D类)苏丹霉素在细胞存在下的稳定性。苏丹霉素与Rh18细胞孵育，乙腈萃取后测定苏丹霉素的含量。(E类)经过24小时二甲基亚砜处理、24小时苏丹霉素E处理（1µM）和30分钟苏丹霉素E脉冲后，随后进行培养基改变和23.5小时培养后，Rh18细胞的细胞周期相。(F类)二甲基亚砜处理24小时、苏丹霉素E处理24小时（10µM）和苏丹霉素E脉冲30分钟后的HKE293细胞的细胞周期阶段，随后进行培养基改变和23.5小时培养。(G公司)与B相似，但使用了1µM苏丹霉素。在HEK293细胞中，一个微摩尔苏丹霉素不会引起大量细胞死亡*P（P）< 0.05; **P（P）<0.01；n个> 4.
图3。
图3。
苏德霉素引起U2复合物的解离。(A类)将Hela核提取物与二甲基亚砜或10µM苏丹霉素孵育2和6 h，并加载15–30%的甘油梯度。梯度（总体积：4ml）分为20个组分，并通过western blot和抗SF3B1抗血清进行分析。灰色阴影区域表示标记蛋白的沉淀，组分1–2：conalbum 5.4 S；6–8：醛缩酶11.5 S；和12-14：铁蛋白17S(B类)在所有梯度下，通过折光法测量甘油浓度。每条线对应于图3A中使用的梯度。
图4。
图4。
苏丹霉素E影响SF3B1与纯化核小体的结合。HEK293。用10µM苏丹霉素处理细胞6 h，并制备核小体。(A类)蛋白质提取后使用溴化乙锭染色琼脂糖凝胶进行核糖体制备的可视化。(B类)核小体沉淀后SF3B1的检测。用抗H3抗血清免疫沉淀核小体，PAGE分离，western blot检测SF3B1。(C类)四个实验的量化。
图5。
图5。
阵列分析以确定苏丹霉素E引起的表达变化。显示了基因表达的变化。饼图显示了最强大的放松管制的京都基因和基因组百科全书路径。(A类)用1µM苏丹霉素E处理Rh18细胞6小时。总的来说，575个基因改变了它们的总体表达。(B类)阵列数据显示，1553个可选外显子发生了改变（1314个盒式外显子，121个互斥外显子和118个可选5′和3′剪接位点）。阵列数据位于补充图S2. (C类)用10µM苏丹霉素E处理Rh18细胞24小时。共有3777个基因在总基因表达和(D类)2117个选择性剪接事件发生改变（1761个卡式外显子，143个互斥外显子和213个选择性5′/3′剪接位点）。阵列数据位于补充数据作为Excel文件。
图6。
图6。
苏丹霉素E对Rh18和HEK293细胞中交替剪接基因的影响。(A类)用1µM苏丹霉素E处理Rh18细胞2、4、6、24小时，并通过PCR评估RPp30、DUSP11、SRRM1、PAPOLG和MLH3转录物的选择性剪接。PCR产物以示意图表示，数字表示其大小。M： 标记；0，无药物；-，水。β-肌动蛋白被用作负荷控制。(B类)HEK293细胞暴露于1µM苏丹霉素E(C类)HEK293细胞暴露于10µM苏丹霉素E。
图7。
图7。
与苏丹霉素E.Rh18细胞短时间孵育后，选择性剪接的变化与1µM苏丹霉素E孵育30分钟。通过改变培养基去除药物，6小时后通过RT-PCR分析细胞RNA。D： 二甲基亚砜对照，S：苏德霉素E。
图8。
图8。
苏德霉素E对整体基因表达的影响。(A类)用1µM苏丹霉素E处理Rh18细胞2、4、6、24小时，并通过PCR评估RPp30、DUSP11、SRRM1、PAPOLG和MLH3转录物的选择性剪接。数字是PCR产物的大小。M、 标记；0，无药物；-，水。(B类)HEK293细胞暴露于1µM苏丹霉素E。
图9。
图9。
苏丹霉素处理后染色质修饰的变化。(A类)用1µM苏丹霉素E处理Rh18细胞6 h，用抗H3K36me3免疫沉淀染色质。所使用的放大器如图所示。(B类)10µM苏丹霉素E处理的HEK293细胞中的类似免疫沉淀(C类)用1µM苏丹霉素E处理Rh18细胞6 h，用抗H3K27me3免疫沉淀染色质。用于实时PCR的带注释启动子区域中的扩增子如图所示。(D类)在HEK293细胞中进行了类似的实验，使用10µM苏丹霉素E 6小时。
图10。
图10。
苏丹霉素治疗后全身染色质的变化。用10µM苏丹霉素处理HEK293细胞6或24 h，并用共焦显微镜进行分析。6小时后，～30%的细胞出现染色质凝聚，局部DAPI染色显示（箭头）。细胞核用DAPI和抗SF3B1的抗血清染色。
图11。
图11。
苏丹霉素E治疗模型。(A类)在积极转录的基因中，U2 snRNP与组蛋白相互作用，从而稳定H3K36me3修饰。U2 snRNP可以与接近替代外显子的组蛋白相互作用。(B类)苏丹霉素E与U2组分SF3B1结合，导致复合物分离。Sudemyin影响可能依赖于与U2 snRNA（白色外显子）碱基配对的替代外显子。去除这些外显子附近的H3K36me3修饰。(C类)H3K36me3修饰的缺失导致染色质凝聚，并可能通过染色质扩散，导致观察到的基因表达变化。
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