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.2014年3月11日；5（2）：e01033-13。
doi:10.1128/mBio.01033-13。

疱疹病毒基因组的普遍转录产生功能上重要的RNA

苏珊·P·坎尼 1, 蒂凡尼·A·里斯, L史蒂文·约翰逊, 张欣, 阿马尔·坎巴尔, 段尔宁, 凯瑟琳·Y·刘, 赫伯特·W·维珍
附属机构

疱疹病毒基因组的普遍转录产生功能重要的RNA

苏珊·P·坎尼等。 mBio公司. .

摘要

在包括人类、小鼠和病毒在内的广泛生物体中观察到了普遍转录，但由此产生的转录物的功能意义仍不明确。当前的遗传学方法往往受到其对蛋白质编码开放阅读框架（ORF）的强调的限制。我们之前从已知ORF和已知基因反义（称为表达基因组区域[EGRs]）之外的小鼠γ-病毒68（MHV68）基因组中发现了广泛的普遍转录。在许多其他疱疹病毒中也发现了类似的反义转录物，包括卡波西肉瘤相关疱疹病毒以及人和鼠巨细胞病毒。尽管它们普遍存在，但这些RNA在病毒生命周期中是否具有任何功能重要性尚不清楚，一种解释是，这些只是由功能不重要的转录事件产生的“噪音”。为了确定疱疹病毒基因组的普遍转录是否产生功能重要的RNA分子，我们使用了一种特定于股的功能方法来靶向MHV68中13个EGR的转录。我们发现来自六个EGR的靶向转录物降低了病毒蛋白的表达，证明了普遍转录可以产生功能重要的RNA。我们使用多种方法（包括RNA测序）详细表征了EGRs 26和27产生的转录物，并鉴定了几个新的聚腺苷化转录物，这些转录物富集在感染细胞的细胞核中。这些数据首次证明了MHV68 EGR产生的普遍转录区域的功能重要性。因此，利用疱疹病毒基因组突变进行的研究必须考虑到普遍转录产生的RNA的可能影响。重要性普遍转录产生功能重要的RNA，这一事实对疱疹病毒遗传研究的设计和解释具有深远的影响，因为此类研究通常涉及基因组的两条链的突变。这是一个常见的潜在问题；例如，保守估计，119450-bp MHV68基因组中有73000个核苷酸转录到注释ORF的反义。认识到独立考虑病毒基因组每一条链的功能的重要性，我们使用链特异性方法来确定促进病毒蛋白表达的基因组编码转录物的六个区域。对于其中两个区域，我们绘制了新的转录物，并确定来自这些区域的靶向转录物减少了病毒复制和其他病毒基因的表达。这是对这些RNA功能的首次描述，并表明来自普遍转录区域的新转录物对病毒的生命周期至关重要。

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数字

图1
图1
ORF6反义寡核苷酸降低ORF6转录和蛋白表达以及晚基因表达。转染靶向ORF6、M3或GFP的ASO或未转染ASO的3T12细胞感染MHV68。（A） 14 hpi下ORF 6或肌动蛋白转录物的代表性Northern印迹，ORF 6单顺反子转录物水平的相应量化标准化为肌动蛋白水平（MOI=10；值是3个实验的平均值[SEM]的平均值和标准误差；**，P（P）成对<0.01t吨测试）。（B） ORF 6和肌动蛋白在18 hpi下的代表性Western blot，以及ORF 6归一化为肌动蛋白的相应定量（MOI=10；数据为8个实验的平均值和SEM；***，P（P）<0.001（成对）t吨测试）。显示了代表性斑点的相关车道。（C） 24 hpi时ORF 4表面表达的流式细胞术分析（MOI=5或10）。流式细胞术数据以每种情况下ORF4阳性细胞的百分比表示，并将其归一化为未转染细胞的值（数据是34到35个重复的平均值和SEM；显示了与GFP相关的具有统计意义的结果；***，P（P）<0.0001，通过单因素方差分析和Dunnett的后验）。（D） 18 hpi下M9或ORF 26的Western blot分析。显示了代表性斑点的相关车道。数据是四个独立实验的代表。
图2
图2
靶向EGRs 9、16、18、23、26和27可降低感染细胞上ORF4的表面表达。用流式细胞术分析转染有指示ASO或未转染的3T12细胞24 hpi时ORF4的细胞表面表达。细胞在MOI为5或10时被感染。在分析EGR的每个实验中，平行纳入对照组。将每种情况下ORF4阳性细胞的百分比归一化为未转染细胞的值。数据是汇集数据和SEM的手段；n、 独立实验的数量。显示了与GFP相关的统计显著结果。*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）<0.001；***，P（P）<0.0001（单因素方差分析与Dunnett后验）。黑条，对照（数据复制自图1C）；灰色条，EGR。
图3
图3
EGR 26和27转录结构。（A） EGR 26-27/M9区域转录本的示意图。相关成绩单下方列出了大致大小和成绩单名称。（B） EGR 26-27/M9区域转录物的Northern blot检测。使用所示探针，通过Northern blot分析在18 hpi（MOI=10）时采集的RNA。通过溴化乙锭染色显示的28S和18S rRNA条带显示了相同的负载，如相应的Northern印迹所示。用探针12和探针2（最右边）分析的Northern blot每个通道有500 ng聚（A）选择性RNA。*，具有与EGR 27转录物A和B相当大小的病毒特异性条带**，文本中引用的较小的EGR 26转录物。
图4
图4
EGR 26和27转录物在感染细胞的细胞核中富集。在18 hpi（MOI=10）条件下，通过Western blotting（A）或Northern blotting。（A） 每个样品装载4微克蛋白质。（B） 分析每个总样本的5微克RNA和核（0.5微克）或细胞质（4.5微克）部分的近似细胞当量。数据是三个独立实验的代表。EGR 26-A表示使用Northern blot探针2检测到的EGR 26转录本A（如图3所示）。EGR 27-A和27-B分别表示使用Northern blot探针11检测到的EGR 27转录物A和B（如图3所示）。
图5
图5
靶向EGR 26和EGR 27转录物对ORF 4表面表达和病毒复制的影响。（A） EGR 26和27示意图。ASO目标的具体坐标见补充材料中的表S1。通过Northern印迹法分析转染有所示ASO的（B至D）3T12细胞在14 hpi时的EGR 27转录本A（B）、EGR 27抄本B（C）或EGR 26转录本B（D）。使用Northern blot探针11检测EGR 27转录本A和B，使用Northern-blot探针2检测EGR 26转录本A。根据实验，每个样品使用1.5至5µg RNA。这些图表是所示转录物信号强度的量化，标准化为肌动蛋白，并表示为来自未转染细胞的信号的一部分。显示了具有代表性的Northern斑点。面板B和C中EGR 27转录物的肌动蛋白被复制，显示相同的斑点。磅符号表示琼脂糖凝胶中撕裂的位置。数据是汇集数据（3到7个实验）和SEM的平均值。（E） 用流式细胞术分析转染有指示ASO的3T12细胞在24 hpi时ORF4的细胞表面表达。如图2所示，将每种情况下ORF4阳性细胞的百分比归一化为未转染细胞的值。数据是汇集数据（5到35个实验）和SEM的平均值。（F） 通过斑块试验分析转染有指示ASO的3T12细胞在24 hpi时的病毒滴度。数据为平均值（3个实验）和SEM。显示了与GFP相关的统计显著结果（*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）<0.001；***，P（P）< 0.0001; 单因素方差分析与Dunnett的后验）。黑色条，控件；蓝色条，EGR 26 ASO；红色条，EGR 27 ASO。
图6
图6
EGR 27对即刻、早期和晚期基因的影响。转染GFP或靶向EGR 27的ASO或未转染ASO的3T12细胞感染MHV68（MOI=10），并分析蛋白质（A和D）或转录水平（B、C和E）。参见ASO位置补充材料中的图5和表S1。（A） 18 hpi时M9和ORF 26蛋白的代表性蛋白质印迹（2或3次实验）。（B） 14 hpi时ORF 29转录水平。对RNA（1µg）进行逆转录（RT），并使用设计用于检测剪接ORF 29转录物或GAPDH的引物通过qPCR分析cDNA。数据是相对ORF 29丰度归一化为GAPDH转录物丰度，并通过∆∆与未转染细胞进行比较C类T型方法（3到8个实验的平均值和SEM）。（C） 14hpi时ORF 6和肌动蛋白的代表性Northern印迹，以及标准化为肌动蛋白的ORF 6转录物水平的相应定量，并与未转染细胞的值进行比较（5至7个实验的平均值和SEM）。（D） 18 hpi下ORF6和肌动蛋白的代表性Western blot（3个实验）。代表性实验的结果显示在面板A中。（E）ORF 50转录水平在14 hpi时通过qRT-PCR测量，而面板B的结果则显示在面板B中。统计分析是通过Dunnett后验的单向方差分析进行的。*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）<0.001；***，P（P）< 0.0001.
图7
图7
EGR 26c ASO减少所有动力学类别的特定基因。转染GFP或EGR 26c ASO或未转染ASO的3T12细胞感染MHV68（MOI=10），并分析蛋白质（A、C和E）或转录水平（B、D和F）。（A） 18 hpi时M9和肌动蛋白的代表性蛋白质印迹（2个实验）。（B） 使用14 hpi的M3或肌动蛋白探针进行代表性Northern杂交，并将M3转录水平的相应量化标准化为肌动蛋白转录水平（来自3个实验的平均值和SEM）。M3 Northern印迹在每条车道上使用0.5微克的RNA。（C） 在18hpi下M3蛋白的代表性蛋白质印迹和标准化为肌动蛋白的M3蛋白水平的相应定量（来自4个实验的平均值和SEM）。（D） 对于转染GFP或EGR 26 ASO的细胞，ORF 6和肌动蛋白在14 hpi的代表性Northern印迹以及ORF 6转录水平归一化为肌动蛋白的相应量化（3到5个实验的平均值和SEM）。（E） 18 hpi下ORF 6和肌动蛋白的代表性Western blot以及归一化为肌动蛋白ORF 6蛋白的相应定量（5个实验的平均值和SEM）。ORF 6的代表性Western blot与图1相同。（F） 14 hpi时ORF 50转录水平。逆转录RNA（1µg），并使用设计用于检测剪接ORF 50转录物或GAPDH的引物，通过qPCR分析cDNA。数据是相对ORF 50丰度标准化为GAPDH转录物丰度，并通过∆∆与未转染细胞进行比较C类T型方法（4个实验的平均值和SEM）。通过配对进行统计分析t吨用Dunnett的后验（D和F）进行检验（A、B、C和E）或单因素方差分析。*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）< 0.001.
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