In vitro Spermatogenesis - Optimal Culture Conditions for Testicular Cell Survival, Germ Cell Differentiation, and Steroidogenesis in Rats

doi:10.3389/fendo.2014.00021

.2014年2月26日5时21分。

doi:10.3389/fendo.2014.0021。 2014年电子收集。

体外精子发生-大鼠睾丸细胞存活、生殖细胞分化和类固醇生成的最佳培养条件

艾哈迈德·雷达¹, 侯弥（Mi Hou）¹, 路易斯·兰德雷¹, 克里斯汀·洛斯·克雅坦斯多蒂尔（Kristín Rós Kjartansdóttir）¹, 康斯坦丁·斯维奇尼科夫¹, 奥尔勒·索德¹, 简·伯恩德·斯图肯博格¹

附属公司

PMID： 24616715
预防性维修识别码： PMC3935156型
内政部： 10.3389/fendo.2014.0021

体外精子发生-大鼠睾丸细胞存活、生殖细胞分化和类固醇生成的最佳培养条件

艾哈迈德·雷达等。前内分泌（洛桑）. 2014.

.2014年2月26:5:21。

doi:10.3389/fendo.2014.0021。 2014年电子收集。

作者

艾哈迈德·雷达¹, 侯弥（Mi Hou）¹, 路易斯·兰德雷¹, 克里斯汀·洛斯·克雅坦斯多蒂尔（Kristín Rós Kjartansdóttir）¹, 康斯坦丁·斯维奇尼科夫¹, 奥尔勒·索德¹, Jan-Bernd Stukenborg公司¹

附属

¹瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所和大学医院妇幼健康部儿科内分泌科Q2:08。

PMID： 24616715
预防性维修识别码：项目经理3935156
内政部： 10.3389/fendo.2014.0021

摘要

尽管三维睾丸细胞培养已被证明能够模拟体内睾丸的组织并支持精子发生，但最佳培养条件和要求仍不清楚。因此，利用已建立的三维细胞培养系统，促进减数分裂前小鼠雄性生殖细胞向细长精子细胞分化，本研究旨在测试不同培养基对生殖细胞分化、Leydig细胞功能和整体细胞存活的影响。从7日龄大鼠睾丸制备的含有所有不同类型睾丸细胞的单细胞悬浮液，在有或无促性腺激素刺激的情况下培养长达31天。根据睾酮的产生和类固醇生成基因的表达来评估睾丸间质细胞的功能。不论使用何种培养基，促性腺激素都能促进细胞的整体存活。在所检测的各种培养基中，Star和Tspo、类固醇生成相关基因的表达最为显著，睾酮的产生量最大，是使用Dulbecco改良的鹰培养基+谷氨酰胺获得的。虽然不能观察到细胞培养液直接促进生殖细胞成熟，但形态学评估结合免疫组织化学染色显示，在三维培养中新生的小管组织不良，允许分化为粗线期精母细胞。无法观察到进一步的分化，可能是因为生殖细胞从细胞集落中迁移出来，从而缺乏支持细胞的支持。总之，本文报道的观察结果表明，在含有所有类型大鼠睾丸细胞的三维培养物中，培养基本身的性质对大鼠睾丸间质细胞的功能产生直接影响，但对生殖细胞的分化没有直接影响，因为支持细胞缺乏适当的组织。

关键词：间质细胞；细胞培养；培养基；精子发生；干细胞生态位；睾丸；睾酮。

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数字

图1
**不同培养基对大鼠睾丸细胞三维培养中Leydig细胞产生睾酮和表达类固醇基因能力的影响**.（A）上*X（X）*-轴是使用的不同培养基 + 谷氨酰胺（GL），F12，F12 + NEAA（非必需氨基酸），F12 + AA（必需氨基酸）、F12/DMEM和MEM（最低必需培养基）]，以及*Y（Y）*-axis描述了培养1小时的细胞培养液中睾酮的浓度（用放射免疫分析法评估，以纳米/升表示）天。的相对表达式**（B）** 星星（类固醇生成性急性调节蛋白）和**（C）** *Tspo公司*（转运蛋白）（通过qPCR分析测定*Actb公司*作为内部控制）通过睾丸细胞悬液从7 d日*聚丙烯*培养1只大鼠在hCG和FSH存在（光柱）或不存在（暗柱）的六种不同培养基中培养一天。通过ddCt程序计算三倍体的平均相对表达。采用单向方差分析和Shapio–Wilk正态性检验来比较不同的实验条件。NS：不显著*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 与DMEM值相比为0.001 + 谷氨酰胺。

图2
**不同DMEM培养基对大鼠睾丸细胞三维培养中Leydig细胞产生睾酮的影响**.细胞培养14 DMEM中的天数 + 谷氨酰胺（GL），DMEM − 谷氨酰胺（GL）或DMEM + 谷氨酰胺（GLMAX）（在*X（X）*-轴）有（光柱）或无（暗柱）hCG和rFSH刺激。以下培养基中睾酮的浓度1 白天**（A）**, 7 天**（B）**、和14 天**（C）**培养物的浓度（通过放射免疫测定法测定，以纳摩尔/升表示）显示在*Y（Y）*-轴。采用单向RM方差分析和Shapio–Wilk正态性检验来比较不同的实验条件*第页 < 0.05,**第页 < 0.01.

图3
**大鼠睾丸细胞三维培养中不同培养基对细胞存活及生殖细胞分化相关基因表达的影响**.（A）细胞培养7 DMEM中的天数 + 谷氨酰胺（GL），DMEM + 谷氨酰胺（GLMAX）或F12（在*X（X）*-轴）有（光柱）或无（暗柱）hCG和rFSH刺激。凋亡（TUNEL阳性）细胞的百分比（标准化为1天值）显示在*Y（Y）*-轴。**（B–E）**细胞培养0、7和21 天。这些图表描述了大鼠的相对表达*Zbtb16号机组*（也称为*普尔兹夫*)**（B）**,*配套元件* **（C）**,*达兹尔* **（D）**、和*Crem公司* **（E）**（通过qPCR分析确定*Actb公司*作为内部控制） + 谷氨酰胺（DMEM + GL），二甲醚 + 谷氨酰胺（DMEM + GLMAX）或F12。上*X（X）*-轴，描述了不同的培养周期[0（D0）、7（D7）和21（D21）天]，并且*Y（Y）*-轴显示了通过ddCt程序计算的重复的平均相对表达。学生的t吨-通过试验比较了不同的实验条件*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001.

图4
**青春期前大鼠睾丸细胞在三维培养中的小管形成和生殖细胞分化**.（A）实验条件的示意图概述。**（B–D）**7日龄大鼠细胞培养3天后产生的细胞集落中未分化精原细胞（Ap-2γ）的免疫荧光染色天**（B、C）**以及作为阳性对照的8日龄大鼠**（D）**[Ap2γ：红色染色（黑色箭头）；DAPI：蓝色染色]。带有IgG的阴性对照显示为**（D）**.（E–G）9-**（E）**，10-**（F），**和11天培养**（G）**显示两个殖民地（黑色和白色箭头）相互迁移。**（H、I、M）**细胞从培养时间长达31天的菌落中主动迁移天[中的白色虚线**（H）**，黑色箭头指向**（百万）**]或将分离的细胞集落在液体培养基中培养5 天[黑色箭头指向**（一）**].（J–L）来源于7天大鼠并培养21天的集落中生殖细胞（Ddx4）的免疫组织化学染色天**（J、K）**以及60日龄大鼠睾丸[阳性对照；**（左）**][Ddx4：棕色染色（黑色箭头）；苏木精：蓝色染色]。**（N）**培养21个细胞日表现出类似于肾小管周细胞（黄星）、支持细胞（白星）、精母细胞和粗线期早期精母细胞（黑色箭头）的形态。

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