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.2014年3月5日；34(10):3674-86.
doi:10.1523/JNEUROSCI.3703-13.2014。

RNA-结合蛋白HuD的产前缺失破坏了出生后大脑皮层回路的成熟和行为

埃里克·M·德波尔 1, 里卡多·阿泽韦多, Taylor A织女星, 杰西·布罗德金, 河藤赤松（Wado Akamatsu）, 冈野秀吉, 乔治·C·瓦格纳, 姆拉登·罗科·拉辛
附属公司

RNA-结合蛋白HuD的产前缺失破坏了出生后大脑皮层回路的成熟和行为

埃里克·M·德波尔等。 神经科学. .

摘要

皮层回路的适当功能取决于适当的神经元亚型规范及其成熟度，以接收适当的信号。这些事件建立了一个平衡的回路，对学习、记忆、情绪和复杂的运动行为都很重要。最近的研究指出，mRNA代谢是这一发育和成熟过程的关键调节器。Hu抗原D（HuD）是一种RNA-结合蛋白，与体外建立神经元特性和神经突起生长有关。因此，我们使用小鼠模型在体内研究了HuD功能丧失对神经元规范和树突发生的作用。我们发现，HuD在发育早期的缺失会导致早期树突状细胞过度生长阶段的缺陷，新皮质下层神经元规范的普遍缺陷，以及海马CA3区树突状体发生的缺陷。随后的行为分析显示，一项依赖于海马的任务——莫里斯水迷宫——的表现存在缺陷。此外，HuD基因敲除（KO）小鼠表现出比野生型小鼠更低的焦虑水平，总体上也不太活跃。最后，我们发现HuD KO小鼠更容易受到听觉诱发的癫痫发作，经常导致死亡。我们的研究结果表明，HuD对于建立新皮质和海马回路是必要的，并且对其功能至关重要。

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数字

图1。
图1。
HuD-GFP在成熟新皮质的下层初级神经元中表达，但在上层神经元中不表达。A类–E类，DAPI（蓝色）、HuD-GFP（绿色）、Tle4（红色）、Cdp（浅蓝色）和合并通道的新皮质壁的代表性10×共焦图像。虚线划分了上部和下部新皮质层。UL，上层；LL，下层。对于A类′–E类'，插图是代表性的60×共焦图像的上部新皮质层；对于A类′′–E类“”，插图是具有代表性的60×共焦图像的下部新皮质层。白色箭头表示HuD-GFP/Tle4+神经元。黄色箭头表示HuD-GFP+/第4层−神经元。F类,F类'，使用抗GFP-DAB染色的HuD-GFP小鼠矢状脑切片的代表性光学显微镜图像（Gong等人，2003）。G公司，HuD-GFP比例的量化+与Tle4（左）和Tle4共定位的神经元+与HuD-GFP共定位的神经元（右）。
图2。
图2。
HuD在Gad67或parvalbumin中不表达+中间神经元，在海马CA1-3和齿状回中表达。A类–D类，分别为海马CA1、CA2、CA3和齿状回的代表性10×共聚焦图像。底部，海马中HuD-GFP表达示意图。红色方框表示捕获典型共焦图像的区域。E类–H（H）DAPI（蓝色）、HuD-GFP（绿色）、Gad67（红色）和合并通道皮层的代表性60×共聚焦图像。我–L（左）DAPI（蓝色）、HuD-GFP（绿色）、parvalbumin（红色）和合并通道皮层的代表性60×共聚焦图像。
图3。
图3。
HuD功能的早期丧失扰乱了下层新皮质初级神经元的规格。A类,B类，成人WT和HuD公司P90处KO。数字和虚线表示从第二层（料箱1）到底板（料箱10）的10个相等的分析料箱。DAPI显示为深蓝色，Tle4显示为红色，Cdp显示为浅蓝色。C类，Cdp数量的量化+或Tle4+每个箱子中的单元格/DAPI的数量+列中的单元格。数字以DAPI的比例报告+Cdp单元格+或Tle4+.每个料仓WT和KO之间的平均料仓比例。D类，Cdp比例的量化+标记神经元总数（Cdp+图4）。E类，Tle4比例的量化+标记神经元总数中的神经元。F类,G公司、成人WT皮质板的典型共焦图像和HuD公司KO，如中所示A类和B类.DAPI显示为深蓝色，NeuN显示为红色。
图4。
图4。
HuD公司功能丧失会破坏深部新皮质层和海马CA3区的树突发生。A类,D类，下层新皮质初级神经元的代表性轨迹(A类)和海马CA3锥体神经元(D类).B类，量化下层新皮质神经元的树突顶端长度、树突末端和节点。C类，量化基底树突长度、树突末端和下层新皮质神经元中的节点。E类，量化CA3锥体神经元的顶端树突长度、树突末端和节点。F类CA3锥体神经元基底树突长度、树突末端和节点的量化。
图5。
图5。
HuD表达从E14.5下降到成年，并变得更具区域特异性。A类–C类，HuD-GFP小鼠矢状脑切片的代表性图像，用抗GFP DAB染色。E14.5、P7和成人（Gong等人，2003）。A类′–C类'，代表图像HuD公司分别在E14.5、P7和成年ISH小鼠的矢状脑切片（Magdaleno等人，2006）。D类,E类E15、P7和成人发育中新皮质的qRT-PCR。P7和成人海马分析。Gapdh用于归一化。值被归一化为E15新皮质D类将值标准化为P7新皮层E类.
图6。
图6。
HuD控制枝晶生长的最早阶段。A类–B类'，示意图子宫内E13.5发育中新皮质中Ctrl-shRNA/RFP（顶部）和HuD-shRNA/GFP的电穿孔和解离。在E13.5用Ctrl-shRNA（RFP）或HuD-shRNA（GFP）电穿孔发育中的新皮质。4小时后，分离并培养新皮质。C类，原代细胞培养电穿孔新皮质分离示意图。D类,D类’，在1和3 DIV进行细胞培养分析的示意图。E类,F类，Ctrl和HuD公司shRNA分别在1DIV转染神经元。G公司,H（H），Ctrl和HuD公司shRNA转染神经元的时间分别为3DIV。我–L（左），1和3 DIV细胞培养中神经突末端的定量。M（M），qRT-PCR分析HuD公司shRNA效率体外试验。Gapdh公司用作标准化控制。
图7。
图7。
光谱分析HuD公司KO表现出整体活动减少，刻板行为增加。对执行每种行为所花费的总时间进行频谱分析，其中HuD公司KO平均值—每个值的WT平均值。分析分为四大类；静止、定向、抬起和移动。
图8。
图8。
HuD公司KO小鼠在Morris水迷宫中表现不佳，在高架正迷宫的开放臂中花费更多时间。A类，在莫里斯水迷宫的五个试验中，按基因型找到可见平台的平均延迟。B类，在连续四天的测试中，每天五次试验中，按基因型找出隐藏平台的平均延迟。C类，按基因型划分的高架迷宫封闭臂和开放臂的平均总时间。D类，按基因型划分，在高架+迷宫开放臂中花费的总时间比例。
图9。
图9。
HuD公司KO小鼠比WT小鼠更容易受到听觉诱发癫痫的影响。所示为未经历癫痫发作、经历癫痫发作并随后恢复或经历癫痫发作但立即死亡的小鼠比例的量化。
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参考文献

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