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.2014年4月；141(7):1453-64.
doi:10.1242/dev.104786。 Epub 2014年3月5日。

一种新的fizzy/Cdc20依赖机制抑制神经干细胞坏死

邝朝元 1, 克里斯塔·L·戈尔登, 克劳迪奥·西蒙, 约翰·达姆拉思, 劳拉·布蒂塔, Caitlin E Gamble公司, 李成宇
附属机构

一种新的fizzy/Cdc20依赖机制抑制神经干细胞坏死

潮元匡等。 开发. 2014年4月.

摘要

肿瘤干细胞可能通过获得使内源性凋亡机制失活的突变或缓慢循环而存活于化疗或放疗。因此，关于替代细胞死亡模式激活与细胞周期机制之间联系机制的知识可能会对新癌症治疗的发展产生变革性影响，但其机制仍完全未知。我们研究了正常抑制凋亡的果蝇幼虫脑神经干细胞（成神经细胞）中替代细胞死亡的调控。通过筛选，我们确定了Cdc20/fizzy（fzy）基因的两个新的功能丧失等位基因，这两个基因导致大脑成神经细胞过早丧失，而不会影响其他二倍体细胞类型的细胞增殖。Fzy是后期促进复合体/环体（APC/C）的进化保守调节因子。携带新fzy等位基因或APC/C功能降低的成神经细胞显示坏死特征。相反，过度表达细胞周期进展所需的典型APC/C底物的不可降解形式的神经母细胞经历有丝分裂突变。这些数据强烈表明，Fzy可以通过抑制坏死诱导APC/C的一种新的促生存功能。经历灾难性细胞应激或过度表达p53的神经母细胞失去Fzy表达并发生坏死。fzy的共同表达抑制这些成神经细胞的死亡。因此，Fzy依赖性生存机制的减弱在灾难性细胞应激和p53下游发挥作用，通过坏死消除成神经细胞。针对Fzy依赖性生存机制的策略可能会导致发现新的治疗方法或补充现有的治疗方法，以通过坏死消除抗凋亡癌症干细胞。

关键词：大脑；灾难性细胞应激；Cdc20/泡沫；果蝇；坏死；成神经细胞。

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数字

图1。
图1。
这个扶正口服液5032突变扰乱了扶正口服液维持成神经细胞，但不促进细胞增殖。（A）扶正口服液5032和扶正口服液AC-10型幼虫脑内神经母细胞逐渐丢失。所示基因型的幼虫在孵化后老化24、48、72或96小时，并对大脑进行神经母细胞标记Deadpan（Dpn）染色。显示了每个脑叶的成神经细胞平均数量(n个=每个基因型10个脑叶）。（B） 成神经细胞在扶正口服液突变克隆。从所示基因型的单个成神经细胞中获得GFP标记的镶嵌克隆的幼虫在克隆诱导后老化24小时，并对大脑进行GFP染色，以鉴定克隆和Dpn。90%以上的野生型克隆来自成神经细胞，每个克隆包含一个成神经细胞。不到10%的野生型克隆来自中间神经前体细胞，不含成神经细胞。显示了缺少可识别成神经细胞的克隆的百分比。（C） 正在恢复扶正口服液功能挽救了神经母细胞丢失表型扶正口服液5032和扶正口服液AC-10型幼虫的大脑。所示基因型的幼虫在孵化后老化72小时，并对大脑进行Dpn染色。扶正口服液tDa公司表示含有整个扶正口服液基因组位点。图中显示了每个脑叶中成神经细胞的平均数量。（D） 由扶正口服液5032或扶正口服液AC-10型突变。（E-H）扶正口服液5032法拉特成人大脑发育不良。（E、G）控制和扶正口服液5032在白色蛹形成后120小时对成虫进行吸食。比例尺：1 mm。（F，H）控制和扶正口服液5032白色蛹形成后，蛹脑老化96小时，苏木精和伊红染色。比例尺：200μm。（I-N）过度表达扶正口服液5032转基因恢复细胞增殖扶正口服液4神经上皮细胞。（I-M）从所示基因型的单个神经上皮细胞中提取的含有GFP标记的镶嵌克隆（轮廓为浅灰色）的幼虫在克隆诱导后老化72小时，并对大脑进行标记染色。Prospero（Pros）是未成熟神经元的标记。比例尺：10μm。（N） 显示了包含两个以上细胞的克隆与包含两个或更少细胞的克隆的百分比。（O-T）过度表达扶正口服液5032转基因延长了细胞增殖扶正口服液4成神经细胞。从所示基因型的单个成神经细胞（浅灰色箭头）衍生出的含有GFP标记的镶嵌克隆的（O-S）幼虫，在克隆诱导后老化72小时，并对大脑进行标记染色。比例尺：10μm。（T） 显示了包含两个以上细胞的克隆与包含两个或更少细胞的克隆的百分比。（U） 分析的总结模型扶正口服液5032等位基因。在本图和随后的所有图中，误差条表示±s.d。；*P（P）与Student’s测定的同一条形图中的对照基因型相比，标记基因型<0.001t吨-测试；n.s.表明，差异在统计上并不显著。
图2。
图2。
神经母细胞扶正口服液5032大脑坏死。（A） 去除凋亡或自噬基因并不能防止神经母细胞的丢失扶正口服液5032大脑。显示了孵化后72小时龄幼虫每个脑叶的成神经细胞平均数量。（B，C）神经母细胞扶正口服液5032大脑表现出坏死的形态学特征。对照组和对照组的透射电子显微照片扶正口服液5032图中显示了孵化后96小时龄幼虫的大脑。B和C中用黄色方框标记的区域的放大倍数较高，如下所示。黑色箭头表示线粒体。比例尺：500纳米。（D-F）成神经细胞扶正口服液5032大脑呈现线粒体聚集。来自控制和扶正口服液5032对幼虫进行线粒体标记ATP5a染色。比例尺：10μm。（F） 线粒体均匀分布（绿色）的成神经细胞与线粒体聚集（蓝色）的百分比。（G-I）神经母细胞扶正口服液5032大脑表现出细胞质ROS产生增加。来自控制和扶正口服液5032携带PCNA:：3XEmGFP转基因用DHE染色。比例尺：20μm。（一） 高活性氧（绿色）与低活性氧（蓝色）的成神经细胞百分比。（J-L）成神经细胞扶正口服液5032大脑显示胞浆钙离子增加。来自控制和扶正口服液5032对幼虫进行GFP染色，检测基因编码钙传感器的表达体内(Wor>GCaMP3.0). 比例尺：20μm。（五十） 图中显示了低细胞质钙（绿色）或高胞质钙（蓝色）的成神经细胞的百分比。（M-O）成神经细胞扶正口服液5032大脑显示泛素结合物的积累。来自控制和扶正口服液5032幼虫被FK2染色，FK2识别与蛋白质结合的泛素（Lee等人，2008）。比例尺：10μm。（O） 显示了含有（蓝色）或不含（绿色）泛素结合物的成神经细胞的百分比。在这里以及随后的所有图中，黄色箭头表示不表达坏死标记的成神经细胞；白色箭头表示表达坏死标志物的神经母细胞。黄色虚线表示视叶和大脑之间的边界。
图3。
图3。
细胞周期进展所需的APC/C底物的异常积累不会导致神经母细胞坏死扶正口服液5032大脑。（A-F）细胞周期进展所需的不可降解的已知APC/C底物的过度表达导致神经母细胞的有丝分裂灾难。来自控制和扶正口服液5032幼虫被Lamin（Lam）和Hoechst染色。沃纽-戈尔4(沃尔)允许神经母细胞特异性过度表达无人机转基因。环腺苷酸Δ170编码不可降解的细胞周期蛋白Ahs-cycB（高速循环B）S公司转基因允许热休克启动子诱导的不可降解细胞周期蛋白B的过度表达。皮姆数据库管理员编码不可降解的Pim。成神经细胞轮廓为黄色。比例尺：10μm。（F） 显示了每个脑叶的平均神经母细胞数量。（G） 有毒蛋白质的异常积累或蛋白酶体功能的阻断不足以诱导成神经细胞的丢失。TDP43（第43页）Δnls编码TDP43的突变形式。VCP公司152H兰特编码VCP的突变形式。散文26B和优点β编码26S蛋白酶体成分的显性-阴性形式。图中显示了每个脑叶中成神经细胞的平均数量。
图4。
图4。
Fzy通过拮抗Aif和JNK信号来维持神经母细胞的存活。（A-E）拆卸aif公司功能延长了扶正口服液5032成神经细胞。（A-D）从所示基因型的单个成神经细胞（浅灰色箭头）衍生出的含有GFP标记的镶嵌克隆的幼虫，在克隆诱导后老化72小时，并对大脑进行标记染色。比例尺：10μm。（E） 每个克隆的平均细胞数。（F） JNK信号的异常激活导致神经母细胞丢失。1塔卡编码野生型Tak1；1塔卡DN（公称直径）编码Tak1的主从形式。第35页编码激活的半胱天冬酶抑制剂。高效液相色谱加利福尼亚州编码Hep的组成型活性形式。问题1对野生类型Ask1进行编码。图中显示了每个脑叶中成神经细胞的平均数量。（G-I）神经母细胞扶正口服液5032大脑显示激活的JNK信号。对来自指定基因型幼虫的大脑进行磷酸化JNK（p-JNK）染色。比例尺：10μm。（I） 有（蓝色）或没有（绿色）p-JNK表达的神经母细胞的百分比。（J-L）去除JNK信号功能可延长扶正口服液5032成神经细胞。从所示基因型的单个成神经细胞（浅灰色箭头）衍生出的含有GFP标记的镶嵌克隆的（J，K）幼虫在克隆诱导后老化72小时，并对大脑进行标记染色。比例尺：10μm。（五十） 每个克隆的平均细胞数。
图5。
图5。
灾难性细胞应激通过减弱Fzy依赖的生存机制诱导成神经细胞坏死。（A） 灾难性细胞应激导致成神经细胞急剧减少。图中显示了每个脑叶中成神经细胞的平均数量。（B-D）经历灾难性细胞应激的成神经细胞表现出坏死标记物。用（B）ATP5a对指定基因型幼虫的大脑进行线粒体形态染色，用（C）GFP对钙含量染色，用FK2对泛素化聚集体染色。显示了具有（蓝色）或不具有（绿色）所示标记表达的成神经细胞的百分比。显示了具有（蓝色）或不具有（绿色）所示标记表达的成神经细胞的百分比。（E-K）经历灾难性细胞应激的成神经细胞失去Fzy表达。对指定基因型幼虫的大脑进行Fzy染色。比例尺：10μm。具有（绿色）或不具有（蓝色）Fzy表达的成神经细胞百分比如E.（L-N）过度表达扶正口服液抑制经历灾难性细胞应激的成神经细胞坏死（在L和M中用黄色表示）。比例尺：10μm。每个脑叶的成神经细胞平均数量如N.（O）所示。这是一幅总结性漫画，展示了灾难性细胞应激如何通过减弱Fzy表达而导致成神经细胞坏死。
图6。
图6。
p53过度表达通过减弱Fzy依赖的生存机制诱导成神经细胞坏死。（A-D）经历灾难性细胞应激的成神经细胞表达p53基因记者转基因。对所示基因型幼虫的大脑进行GFP染色，这表明GFP的表达第53页-RE-绿色荧光粉记者转基因。比例尺：10μm。（D） 显示了具有（绿色）或不具有（蓝色）GFP表达的神经母细胞的百分比。（E-G）拆卸p53基因功能抑制神经母细胞坏死分1突变体大脑。比例尺：10μm（E，F）。（G） 每个脑叶中成神经细胞的平均数量。（H） 的过度表达p53基因导致神经母细胞丢失。图中显示了每个脑叶中成神经细胞的平均数量。（I-K）过度表达p53的成神经细胞坏死标记物阳性。对来自指定基因型幼虫的大脑进行处理，用（I）ATP5a染色以检测线粒体形态，用（J）GFP染色以检测钙含量，用（K）FK2染色以检测泛素化聚集体。显示了具有（蓝色）或不具有（绿色）所示标记表达的成神经细胞的百分比。（L-N）神经母细胞过度表达p53基因失去了Fzy的表情。比例尺：10μm（L，m）。具有（绿色）或不具有（蓝色）Fzy表达的成神经细胞百分比如N（O）所示扶正口服液抑制神经母细胞过度表达导致的坏死p53基因显示了每个脑叶的成神经细胞平均数量。
图7。
图7。
Fzy依赖生存机制的减弱将灾难性细胞应激与成神经细胞坏死的激活联系起来。（A） Fzy通过APC/C依赖性机制靶向一种未鉴定的坏死激活剂进行降解，从而维持神经母细胞的存活。野生型Fzy（蓝色）招募假定的坏死激活剂进行降解（紫色）。《狂人》5032突变蛋白不能将坏死激活物募集到APC/C，导致成神经细胞坏死。
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