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.2014年4月11日；289(15):10431-10444.
doi:10.1074/jbc。M113.541839。 Epub 2014年2月28日。

乳腺癌抗雌激素抵抗蛋白1（BCAR1）和BCAR3支架蛋白在细胞信号转导和抗雌激素抵抗中的关系

亚恩·沃利兹 1, 斯特凡·J·里德尔 1, 埃琳娜·巴斯奎尔 2
附属公司

乳腺癌抗雌激素抵抗蛋白1（BCAR1）和BCAR3支架蛋白在细胞信号转导和抗雌激素抵抗中的关系

Yann Wallez公司等。 生物化学杂志. .

摘要

大多数乳腺癌都是雌激素受体阳性，并用抗雌激素治疗，但异常的信号网络可以诱导耐药性。其中一个网络涉及支架蛋白BCAR1/p130CAS，它调节细胞生长和迁移/侵袭。SH2结构域蛋白BCAR3是一种研究较少的支架蛋白，它也具有抗雌激素抵抗作用。BCAR1和BCAR3通过其C端域紧密绑定，从而潜在地连接其相关的信令网络。然而，最近使用BCAR1和BCAR3相互作用突变体的研究得出结论，这两种蛋白之间的关联对于它们调节乳腺癌恶性程度的许多相关活动并不重要。我们报告说，这些先前使用的BCAR突变未能引起复合体的充分功能丧失。通过使用缺乏相互作用能力的基于结构的BCAR1和BCAR3突变体，我们表明BCAR3在MCF7乳腺癌细胞中诱导的抗雌激素耐药性主要取决于其结合BCAR1的能力。与BCAR3的相互作用增加磷酸化BCAR1的水平，最终增强BCAR1依赖性抗雌激素抵抗。此外，过度表达BCAR1/BCAR3的细胞的抗雌激素抵抗与ERK1/2活性增加相关。通过调节蛋白PEA15的过度表达抑制ERK1/2可抵消耐药性，揭示ERK1/2在BCAR1/BCAR3诱导的抗雌激素耐药性中的关键作用。逆相蛋白阵列数据显示，侵袭性乳腺癌中PEA15水平与患者生存率相关，表明PEA15可以通过BCAR1/BCAR3和其他上游调节物覆盖ERK1/2的激活。我们进一步发现BCAR3相关的NSP3也可以促进抗雌激素抵抗。因此，破坏BCAR1-BCAR3/NSP3复合物和相关信号网络的策略可能最终导致新的乳腺癌治疗。

关键词：抗癌药物；乳腺癌；癌症；耐药性；ERK1/2；MAP激酶；间充质表型；NSP3；PEA15；蛋白质-蛋白质相互作用。

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数字

图1。
图1。
BCAR3或BCAR1结合表面上的多个残基的结构导向突变破坏了它们的相互作用并消除了关键的信号事件。 一BCAR3野生型的稳定慢病毒转导(重量)或MCF7乳腺癌细胞中的L748E单一突变同样增加了BCAR1水平、BCAR1底物结构域酪氨酸磷酸化（用磷酸化Tyr-410抗体检测）以及过度磷酸化BCAR1上带的比例(顶部箭头). BCAR1印迹的放大也包括在内，以更清楚地显示BCAR1上下条带，其由两个箭头相反，L744E/R748E双突变体失去了这些活性。V（V），空慢病毒载体控制。用所示抗体通过免疫印迹法检测细胞裂解物。BCAR1抗体非特异性识别的条带表明车道的荷载相等（荷载控制）。b条BCAR1-BCAR3复合体是通过将BCAR3 C末端结构域（PDB:3T6A）的晶体结构叠加到BCAR1和NSP3 C末端结构畴（PDB ID 3T6G）的复合体结构上来建模的。这两个域如示意图所示，结合界面中突变的残基如所示球表示(左边、BCAR3、，橙色;正确的，BCAR1，绿色).c（c）通过共免疫沉淀测定BCAR1和BCAR3突变对这两种蛋白之间关联的影响(IP（IP）)转染空载体对照、EGFP-BCAR1和BCAR3野生型或突变质粒的指定组合的HEK293细胞。为了避免免疫沉淀抗体可能干扰BCAR1-BCAR3的结合，用EGFP标签的抗体免疫沉淀BCAR1（也用于通过免疫印迹检测EGFP-BCAR1），用N末端附近的表位抗体免疫沉淀BCAR3。还对细胞裂解物进行了检测，发现BCAR3 L744E和L744E/R748E突变体的低表达，这可能是因为它们与野生型和转染的BCAR1的相互作用受损。GAPDH被视为一种负荷控制。突变：744，L744E；748，R748E；787，L787E；794，F794R。d日，在HEK293细胞中瞬时转染BCAR1增加了共转染的野生型BCAR3的水平，并且BCAR1的BCAR3相互作用结构域中的不同突变在不同程度上削弱了这种作用。用空载体对照瞬时转染细胞(V（V）)或与BCAR3 WT质粒和BCAR1野生型L787E(787)或F794R(794)单突变体或BCAR1 L787E/F794R双突变体。用所示抗体通过免疫印迹法检测细胞裂解物，GAPDH免疫印迹显示通道的负载相等。
图2。
图2。
BCAR3和相关的NSP3诱导膜褶皱的形成，这需要与BCAR1形成复合物。 一，用仅编码ZsGreen的慢病毒载体稳定转导的MCF7细胞群(V（V）)或与野生型BCAR3一起使用(重量)，BCAR3 R748E单突变体(748)或BCAR3 L744E/R748E双突变体(744/748)用阴茎肽染色以标记丝状肌动蛋白(顶行)或抗BCAR3抗体(最下面一行). 还对经卵磷脂染色的细胞进行ZsGreen荧光成像，以从双顺反子转录物中识别表达BCAR3和ZsGrean的细胞(中间一排). 与载体控制细胞相比，BCAR3野生型和R748E单突变体都能促进膜皱褶的形成(箭头点而BCAR3 L744E/R748E双突变体没有。此外，皱褶中有明显的BCAR3免疫反应。比例尺=25微米。b条，直方图显示包含皱褶的ZsGreen表达细胞的百分比。**，第页<0.01，和***，第页通过单向方差分析和Dunnett的事后检验与载体控制感染细胞进行比较，结果<0.001。c（c）MCF7细胞中BCAR3和NSP3的过度表达促进了含有BCAR1的膜皱褶的形成。免疫标记显示内源性BCAR1的水平和亚细胞定位(箭头指出褶边的例子）。ZsGreen荧光从双顺反子转录物中鉴定表达BCAR3或NSP3的细胞。比例尺=40微米。
图3。
图3。
BCAR3和相关NSP3促进抗雌激素抵抗，这需要与BCAR1复合形成。 一，用仅编码ZsGreen的慢病毒载体稳定转导的MCF7细胞群(V（V）)或与野生型或突变型BCAR3一起在雌激素受体拮抗剂ICI182780存在下生长33天。直方图显示了三次测量的平均值±S.E。还显示了培养物的倍增时间（以天为单位）酒吧上方. ***,第页通过单向方差分析和Dunnett的事后检验与载体控制感染细胞进行比较，结果<0.001。BCAR3双突变体（而非单突变体）失去了促进抗雌激素抵抗的能力。与野生型BCAR3相比，BCAR3 R748E单突变体的表达稍高，因此在BCAR3中观察到较高的生长率（见图1一).b条相位对比图显示ICI182780处理5天对用控制载体或BCAR3双突变体转导的细胞形态的不利影响，而BCAR3野生型和R748E突变体的表达具有更健康的外观，这与它们更快的增殖一致。比例尺=100微米。c（c）在ICI182780存在下培养35天，稳定表达BCAR3、NSP3α、NSP3-β或载体对照的MCF7乳腺癌细胞群。直方图显示了三次测量±S.E的平均值。显示了每个细胞群的加倍时间，单位为天每根钢筋上方.*中，第页< 0.05, ***,第页通过单向方差分析和Tukey的事后检验与对照载体感染细胞进行比较，结果<0.001。其他比较，以表示酒吧，也显示了；纳秒，不显著。d日用所示抗体通过免疫印迹法检测稳定表达BCAR3、NSP3α、NSP3-β或载体对照的MCF7乳腺癌细胞群的裂解物。虽然所用的NSP3抗体可能比NSP3α识别更好的NSP3-β（参见“实验程序”），但用识别C末端的NSP3/抗体进行免疫印迹也表明NSP3β比NSP3-α表达更高。BCAR1印迹的放大也包括在内，以更清楚地显示BCAR1的上下条带，其标记为两个箭头GAPDH被用作加载控制。
图4。
图4。
BCAR1-BCAR3相互作用对抗雌激素抵抗和信号网络的影响。表达BCAR1/BCAR3 WT、BCAR3 L744E/R748E突变体的慢病毒转导MCF7乳腺癌细胞群(M（M）)，BCAR1 L787E/F794E/D797R突变体(M（M）)或适当的控制慢病毒载体(V（V）)在ICI182780存在下生长35天。直方图显示了三次测量的平均值±S.E。显示了每个细胞群的加倍时间（以天为单位）每个酒吧上方.在没有ICI182780的情况下，亲本细胞的倍增时间为2天。***，第页通过单向方差分析和Tukey的事后检验与对照载体感染细胞进行比较，结果<0.001。其他比较，以表示酒吧，也显示了；纳秒，不显著。在免疫印迹中，用所示抗体探测ICI182780处理8天的细胞裂解物。
图5。
图5。
BCAR1/BCAR3诱导的抗雌激素抵抗需要ERK1/2活性。用编码EGFP的慢病毒感染具有或不具有稳定BCAR3慢病毒表达的MCF7细胞群，或与PEA15野生型或PEA15 R71E突变株融合。然后在ICI182780存在下培养细胞39天。直方图显示了三次测量的平均细胞数±S.E。每个细胞群的倍增时间（以天为单位）显示在每个细胞群上方酒吧. *,第页< 0.05; ***,第页< 0.001;纳秒，与表达EGFP的对照细胞相比无显著性差异(第一条车道)通过单向方差分析和Tukey的事后检验。其他比较，以表示钢筋图中还显示了。免疫印迹显示ICI182780处理4天的细胞裂解物，并用指示的抗体进行探测。PEA15可对抗MCF7细胞中BCAR3过度表达诱导的雌激素依赖性生长。
图6。
图6。
侵袭性乳腺癌中PEA15的表达水平与ERK1/2磷酸化和患者总体生存率相关。对来自TCGA临时浸润性乳腺癌研究的408个肿瘤的大规模逆相蛋白阵列数据进行了分析。左上，方框图表示包括具有最高PEA15表达的28%的肿瘤（丰度z评分>0.4，平均丰度z评分=1.21）和包括其余72%的肿瘤（丰度z评分<0.4，平均z评分=-0.48）的组。中间偏左PEA15表达最高的肿瘤中ERK1/2磷酸化-Thr-202水平的箱线图表示（平均磷酸化-ERK1/2丰度z评分=0.18）与其余肿瘤（平均磷酸化-ERK1/2丰度z评分=−0.07，第页=0.03，针对双侧双样本学生的磷酸-ERK1/2水平差异t吨测试）。左下角，PEA15表达水平最高的肿瘤患者的存活时间明显长于其余患者（Kaplan-Meier图，第页=0.010（通过log-rank测试），尽管其磷酸-ERK1/2水平较高。右上，Boxplot表示该组包括34%PEA15表达最低的肿瘤（丰度z评分<-0.5，平均z评分=−0.98），以及包括其余66%肿瘤的组（丰度z评分>-0.5，均匀z评分=0.51）。中间偏右，PEA15表达最低的肿瘤中磷酸化ERK1/2水平的箱形图表示（平均ERK1/2磷酸化-Thr-202丰度z评分=-0.17）与其余肿瘤（平均磷酸化-ERK1/2丰度z评分=0.09，第页=0.014，针对双侧双样本学生的磷酸-ERK1/2水平差异t吨测试）。右下角，表达最低水平PEA15的肿瘤患者存活率显著低于其余患者（Kaplan-Meier图，第页=0.003（通过log-rank测试），尽管其磷酸化-ERK1/2水平较低。箭头在箱线图中标记中值。
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