跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息,确保你在联邦政府政府网站。

HTTP服务器

该站点是安全的。
这个https(https)://确保您连接到官方网站,并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2014年4月4日;289(14):9502-18.
doi:10.1074/jbc。M113.505743。 Epub 2014年2月19日。

缝隙隔膜蛋白Neph1及其信号转导:保护足细胞免受肾小球损伤的新治疗靶点

附属公司

缝隙隔膜蛋白Neph1及其信号转导:保护足细胞免受肾小球损伤的新治疗靶点

埃特沙姆·阿里夫等。 生物化学杂志. .

摘要

足细胞是特殊的上皮细胞,是肾小球滤过屏障的关键组成部分,其功能障碍会导致蛋白尿和肾功能衰竭。因此,保护足细胞功能具有重要的治疗意义。在本研究中,我们将Neph1信号通路确定为一个治疗靶点,该靶点在抑制后可防止足细胞受到肾小球损伤诱导剂嘌呤霉素氨基核苷(PAN)的损伤。为了特异性抑制Neph1信号转导,我们使用了一种蛋白质转导方法,在用PAN处理之前,在培养的足细胞中转导Neph1(Neph1CD)的细胞质域,该细胞质域标记有转录的蛋白质转导域反激活剂。在Neph1CD转导的细胞中,PAN诱导的Neph1磷酸化显著降低;此外,这些细胞对PAN诱导的细胞骨架损伤具有抵抗力。亚分馏研究的生化分析表明,与对照细胞不同,经PAN处理后,转导细胞的脂筏组分中保留了Neph1,表明足细胞中Neph1CD的转导可以防止PAN诱导的Neph1定位错误。据此,免疫荧光分析进一步表明,Neph1CD-转导的细胞在PAN诱导的损伤中增加了在膜上保留内源性Neph1的能力。当血管紧张素被用作损伤诱导剂时,也得到了类似的结果。与这些观察结果一致,使用过度表达嵌合Neph1的足细胞细胞系在膜上保持高水平Neph1,可提高足细胞抵抗PAN诱导的损伤和PAN诱导白蛋白渗漏的能力。利用斑马鱼体内PAN和阿霉素损伤模型,我们进一步证明了转导的Neph1CD保留肾小球功能的能力。总之,这些结果支持抑制Neph1信号传导在预防足细胞损伤肾小球损伤方面具有治疗意义的结论。

关键词:肌动蛋白;细胞信号;肾;Neph1;磷酸化;足细胞;肾损伤。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
TAT-Neph1-CD在足细胞中转导并保持功能。 A中,纯化重组表达的TAT-Neph1CD,分别用考马斯染色和Neph1抗体Western blotting检测其纯度和特性。B、,在培养的足细胞中转导TAT-Neph1CD蛋白(5μg/ml),转导时间为30分钟至24小时,并进行Western印迹(工作分解结构)带有Neph1抗体。该蛋白在30分钟内在细胞内迅速转导,甚至在转导后24小时也能检测到。C、,以类似的方式,TAT-GFP被转导指定的时间,并用作对照。D中,在培养的人足细胞中转导TAT-Neph1CD 30分钟,洗涤并用4%PFA(1×PBS)固定。他的一级抗体和Alexa Fluor 594二级抗体用于标记转导的TAT-Neph1CD(箭头)用荧光显微镜(×60倍放大)进行免疫荧光成像分析。此外,通过差异干涉对比观察细胞(驾驶员信息中心)显微镜检查。E、,用德克萨斯红染料标记TAT-Neph1CD蛋白,并在培养的人足细胞中转导30分钟。然后用4%PFA清洗细胞并固定(在1×PBS中)并通过免疫荧光成像进行分析,显示与未转导的对照足细胞相比,转导的足细胞内荧光TAT-Neph1CD显著积聚。F、,TAT-Neph1CD转导的统计分析D类表明94.6±1.5%的足细胞转导了该蛋白。G、,德克萨斯红TAT-Neph1CD转导的统计分析表明,96.3±1.5%的足细胞转导了该蛋白。H、,对转导和未转导的足细胞进行TUNEL分析。用比足细胞中TAT-Neph1CD的常规剂量(5μg/ml)高10倍(50μg/ml。还获得了亮场和DAPI图像,以可视化整个细胞群。我,转导的TAT-Neph1CD与内源性ZO-1相互作用的能力在Ni-NTA珠的下拉实验中进行了检测。用TAT-Neph1CD转导的足细胞进行裂解,用镍珠拉下Neph1-ZO-1复合物,在SDS-PAGE上分离,并用Western blotting分析以检测复合物中是否存在ZO-1。比例尺,10微米(D类),20微米(E类); 20微米(H(H)).
图2。
图2。
转导的TAT-Neph1CD抑制内源性Neph1的酪氨酸磷酸化。 A中,用TAT-GFP或TAT-Neph1CD转导的足细胞用PAN处理48小时,用Western blotting分析细胞裂解液中是否存在磷酸化的Neph1(工作分解结构)含磷酸-Neph1(p-Neph1型)和Neph1抗体。与对照组相比,足细胞中TAT-Neph1CD的转导显著降低了PAN诱导的内源性Neph1磷酸化。B、,进一步的密度分析显示,与TAT-GFP转导细胞相比,TAT-Neph1CD转导细胞中PAN诱导的内源性Neph1磷酸化降低了60-70%。
图3。
图3。
TAT-Neph1CD转导抑制了内源性Neph1对PAN反应中非脂筏组分的再分布。 A–D,使用或不使用PAN处理TAT-GFP-和TAT-Neph1CD转导的足细胞,并使用Optiprep梯度进行亚分馏。裂解产物在SDS-PAGE上运行,转移到硝化纤维素中,并进行Western blotted(工作分解结构)使用Neph1、Myo1c、小窝蛋白1、转铁蛋白受体和肌动蛋白抗体。PAN诱导内源性Neph1向非脂筏组分(5-8)的再分配如所示B类而用TAT-Neph1CD治疗(D类)在脂筏部分保留Neph1(3)。E、,对PAN处理的细胞进行的密度分析表明,脂筏中Neph1损失了70%(标记为虚线框)通过TAT-Neph1CD转导恢复。
图4。
图4。
TAT-Neph1CD的转导可防止PAN诱导的足细胞膜Neph1的丢失。 A中,用针对肌动蛋白和Neph1胞外结构域的抗体通过免疫荧光分析转导的细胞(Neph1-Ex公司). 共聚焦图像以×60倍放大率采集,并在年进行反褶积后呈现XY公司XZ公司方向。B、,对转导细胞膜上平均像素强度的分析表明,PAN处理显著降低了Neph1在膜上的定位(第页<0.05)在对照细胞中(TAT-GFP公司+聚丙烯腈)而用TAT-Neph1CD转导的细胞在足细胞膜上保持Neph1的稳定定位,并且不受PAN处理的影响。纳秒,不重要。比例尺A,10微米。
图5。
图5。
TAT-Neph1CD转导的足细胞能够抵抗PAN诱导的细胞骨架损伤。 A类B、,TAT-GFP-和TAT-Neph1CD转导的足细胞用PAN处理指定的时间段(0–48 h),并用生殖器肽(Alexa 488)和Neph1(Alexa594)进行免疫染色,并用DAPI进行贴装。共聚焦成像显示,PAN处理导致TAT-GFP转导细胞中肌动蛋白细胞骨架的剧烈变化。此外,包括Neph1在内的连接蛋白在这些细胞中的分布也发生了显著改变。相反,用TAT-Neph1CD转导的足细胞的PAN处理显示肌动蛋白细胞骨架的改变最小,Neph1在连接处的定位增加。共聚焦图像以×60倍放大率采集,并在年进行反褶积后呈现XY公司XZ公司方向。B、,通过在细胞-细胞交界处放置一条线来创建像素强度剖面,并使用ImageJ软件进行分析。该分析表明,用PAN处理的TAT-Neph1CD转导细胞中,细胞-细胞连接处Neph1的强度保持不变(第页< 0.05).比例尺,10微米(A类).
图6。
图6。
用PAN处理的TAT-Neph1CD转导的足细胞中保留了细胞接触。 A类B、,足细胞用VybrantóDiI细胞膜标记染料进行标记,以便于观察细胞边界。对参与细胞间接触的足细胞数量进行了鉴定和分析。通过分析每组100个细胞(一式三份)计算细胞与细胞的接触,与相邻细胞接触的细胞表面超过50%(使用肌动蛋白和膜DiI染色图像手动定义)被视为阳性。TAT-GFP转导的足细胞在细胞-细胞接触中显著减少,因此,PAN处理48小时后,参与接触形成的细胞数量显著减少;相比之下,经PAN处理的TAT-Neph1CD转基因细胞中细胞与细胞之间的接触得到了很好的保存。比例尺,10微米(A类).
图7。
图7。
TAT-Neph1CD转导的足细胞对Ang II诱导的细胞骨架损伤具有抵抗力。 A类B、,用Ang II处理TAT-GFP-和TAT-Neph1CD转导的足细胞,处理时间为指定的时间段(0–48 h),并用阴茎倍体素(Alexa 488)和Neph1(Alexa594)进行免疫染色,并用含有DAPI的安装介质进行安装。共聚焦成像显示,Ang II治疗导致肌动蛋白细胞骨架发生变化(注意到应力纤维增加),同时细胞-细胞连接处Neph1丢失(A类). 值得注意的是,TAT-Neph1CD的转导阻止了这些变化(见图5A类). 共聚焦图像在×60倍放大下采集,并在反褶积后构建XY公司XZ公司方向。B、,利用像素强度分布进行定量分析进一步证明,与PAN类似,与经Ang II处理的TAT-GFP转导细胞相比,经AngⅡ处理的TAT Neph1CD转导细胞在细胞-细胞连接处Neph1的损失最小(第页< 0.05).比例尺,10微米(A类).
图8。
图8。
足细胞过度表达Neph1对PAN诱导的损伤具有抵抗力。 A中,图中显示了Cherry-Neph1结构体构建的示意图(其中Cherry在跨膜结构域之后和Neph1中任何潜在酪氨酸磷酸化位点之前引入)。B、,Cherry-Neph1在足细胞中的表达模式与内源性Neph1相似,这两种蛋白都位于细胞-细胞连接处(箭头).C、,创建不表达和稳定表达Cherry-Neph1的足细胞,并对其进行PAN处理48h。与空白载体转染的对照细胞不同,Cherry-Neph1转染的细胞对PAN诱导的细胞骨架损伤具有抵抗力,并且其细胞-细胞连接保持良好。D中,用载体转染(对照)和Cherry-Neph1过度表达的足细胞进行BSA渗透性分析,足细胞在Transwell过滤器上作为单层培养,并用PAN处理。通过使用德克萨斯州红标白蛋白的细胞旁白蛋白通量测定评估白蛋白通过足细胞单层的情况。与对照足细胞相比,Cherry-Neph1过度表达的细胞对PAN诱导的白蛋白泄漏表现出更强的抵抗力。纳秒,不重要。比例尺,20微米(B类); 10微米(C类).
图9。
图9。
注射TAT-Neph1CD的斑马鱼对PAN和Ang II诱导的损伤具有抵抗力。 A中,将PAN(25 mg/ml)与0.25 mg/ml的TAT-GFP(对照组)或TAT-Neph1CD(试验组)通过总主静脉共同注射到72小时的斑马鱼体内,并在96小时时监测心包水肿的发展。对照组的心包水肿和弯曲体形显著增加,而试验斑马鱼的水肿很小或没有,其体形基本正常。B、,三个独立实验的定量分析表明,与对照组相比,试验斑马鱼PAN诱导的水肿减少了约40%。C类D中,注射0.25 mg/ml TAT-GFP(对照)或TAT-Neph1CD(试验)的胚胎在含有阿霉素(30.3 mg/L)的E3培养基中生长。在96 hpf时观察到表型(心包水肿是肾脏异常的迹象)(在该模型中90%以上的胚胎发生水肿)。然而,注射TAT-Neph1CD后,患有心包水肿的斑马鱼胚胎数量显著减少。D中,定量分析进一步表明,与注射TAT-GFP的胚胎相比,注射TAT-Neph1CD的胚胎心包水肿减少了25%(第页< 0.05).E、,对72 hpf经阿霉素处理并经苏木精和伊红染色的TAT-GFP注射胚胎切片的组织学分析显示,前肾小管明显扩张,而经阿霉素治疗的TAT-Neph1CD注射胚胎则无此表型。F、,的示意图体内用转基因斑马鱼从肝脏表达GFP-VDBP进行过滤试验。注射TAT-Neph1CD和未注射的斑马鱼用阿霉素治疗以诱导肾小球损伤,并在培养基中估计排泄的GFP-VDBP。G、,注射TAT-Neph1CD的斑马鱼胚胎表现出明显的减少(~30%第页与对照胚胎相比,培养基中排泄的GFP-VDBP值<0.05)。
图10。
图10。
拟议TAT-Neph1CD行动的示意图。内源性Neph1的酪氨酸磷酸化增加是对PAN的反应,PAN诱导下游信号导致细胞骨架损伤和肾功能衰竭。TAT-Neph1CD的转导竞争内源性Neph1相互作用,从而阻断Neph1磷酸化并抑制下游信号传导。因此,转导细胞无法对损伤作出反应,因此可以保护其免受PAN诱导的足细胞损伤。

类似文章

引用人

工具书类

    1. Haraldsson B.,Nyström J.,Deen W.m.(2008)肾小球屏障的特性和蛋白尿的机制。生理学。修订版88,451–487-公共医学
    1. Pavenstädt H.、Kriz W.、Kretzler M.(2003)肾小球足细胞的细胞生物学。生理学。第83版,253–307-公共医学
    1. Tryggvason K.、Patrakka J.、Wartiovaara J.(2006年)《遗传性蛋白尿综合征和蛋白尿机制》,英国国家出版社。《医学杂志》354、1387–1401-公共医学
    1. Tryggvason K.,Pikkarainen T.,Patrakka J.(2006)Nck将肾足细胞中的肾素与肌动蛋白联系起来。手机125、221–224-公共医学
    1. Verma R.、Kovari I.、Soofi A.、Nihalani D.、Patrie K.、Holzman L.B.(2006)Nephrin外结构域参与导致Src激酶激活、Nephrin-磷酸化、Nck募集和肌动蛋白聚合。临床杂志。投资。116, 1346–1359-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

MeSH术语