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.2014年2月25日；111(8):3098-103.
doi:10.1073/pnas.1308953111。 Epub 2014年2月10日。

EZH2通过激活NOTCH1信号传导扩大乳腺干细胞

玛丽亚·冈萨雷斯 1, 希瑟·M·摩尔, 辛莉（Xin Li）, 凯西A玩具, 魏黄, 迈克尔·萨贝尔, 凯利·M·基德威尔, 席琳娜·G·克勒
附属公司

EZH2通过激活NOTCH1信号传导扩大乳腺干细胞

玛丽亚·冈萨雷斯等。 美国国家科学院程序. .

摘要

乳腺癌是女性癌症相关死亡的第二大原因，但它是如何开始的细节仍然难以捉摸。越来越多的证据支持侵袭性三阴性（TN）乳腺癌与Zeste Homolog 2的Polycomb组蛋白增强子（EZH2）的高表达和肿瘤起始细胞（TICs）的增加有关。然而，EZH2和TICs之间的机制联系尚不清楚，也缺乏EZH2体内致瘤功能的直接证明。在这里，我们确定了一个未知的EZH2/NOTCH1轴，它控制TN乳腺癌中的乳腺TIC。EZH2过度表达增加了NOTCH1的表达和信号传导，并且抑制NOTCH2活性可以阻止EZH2-介导的干细胞在非肿瘤性乳腺细胞中的扩增。我们揭示了EZH2通过与TN乳腺癌细胞中的NOTCH1启动子结合，在激活而非抑制NOTCH2信号传导方面的独特作用。EZH2结合独立于其催化组蛋白H3赖氨酸27甲基转移酶活性和Polycomb抑制复合物2，但与转录激活标记相对应。在体内，EZH2基因敲除可减少TN乳腺TICs来源的异种移植物的发生和数量。相反，转基因EZH2过度表达可加速小鼠乳腺肿瘤病毒荷瘤小鼠乳腺肿瘤的发生并增加NOTCH1的激活。与这些发现相一致的是，在临床样本中，高水平的EZH2与TN浸润性癌中NOTCH1蛋白激活和TICs增加显著相关。这些数据揭示了EZH2水平、NOTCH1信号传导激活和TICs之间的功能和机制联系，并提供了之前未确定的证据，证明EZH2促进乳腺癌的发生。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
EZH2 KD降低TN乳腺癌的TIC，并导致NOTCH1通路抑制。(A类)带有EZH2-靶向shRNA（shEZH2）的SUM149细胞与打乱shRNA的免疫印迹比较。使用myc标记的EZH2-encoding腺病毒暂时拯救EZH2。广告控制，腺病毒控制。条形图显示每5×10的平均球体数±SD4电镀电池(*P（P）= 0.0001; **P（P）≤ 0.0004). 培养7天后球体的代表性图像。（放大倍数：200×。）(B类)EZH2型SUM149 ALDH1的定量RT-PCR+和ALDH1−单元格(*P（P）= 0.0001). (C类)ALDH1型+和ALDH1−用流式细胞术分离SUM149 EZH2 KD或对照细胞群，1×104将细胞注射到NOD/SCID小鼠清除的乳腺脂肪垫中(n个=每种情况10只小鼠）。EZH2 KD显著降低SUM149 ALDH1形成的肿瘤体积+单元格与控件进行比较。所有条件下注射后5-10周的平均肿瘤体积±扫描电镜（混合回归模型*P（P）=0.04和**P（P）= 0.004). (D类)中描述的单元格C类进行qRT-PCR槽口家族基因。
图2。
图2。
EZH2介导的乳腺干细胞扩增需要NOTCH1途径激活。(A类,左侧)DOX诱导的MCF10A pLVX-EZH2细胞的免疫印迹以及抗EZH2-和抗NICD1的对照。在DOX前24小时添加GSI（17 nM，持续3天）。培养7天后的乳房球代表性图像。（放大倍数：200×。）(A类,赖特)DOX诱导和对照的MCF10A pLVX和pLVX-EZH2细胞（有或无GSI）的乳腺检测平均球数±SD每5×104第二代电镀细胞(*P（P）< 0.0001). (B类)流式细胞术检测CD44+/CD24型−MCF10A pLVX-EZH2 Dox诱导和控制的种群。在DOX前24小时添加GSI（1.7 nM，持续7天）。百分比以±SD表示(*P（P）≤ 0.005). (C类)DOX诱导和对照的MCF10A pLVX和pLVX-EZH2细胞的免疫印迹和乳腺检测，DOX前24小时用NOTCH1 siRNA处理或打乱对照。平均球数±SD每5×104第二代电镀细胞(*P（P）< 0.0005).
图3。
图3。
EZH2以HMT活性无关的方式调节NOTCH转录活性并扩增干细胞。(A类)myc标记的EZH2缺失突变体示意图：ΔSET、ΔHI（同源域I）、ΔHII（同源域II）和ΔNLS（核定位信号）。(B类,顶部)GFP-NOTCH启动子报告检测MCF10A细胞过度表达全长EZH2、EZH2-缺失突变体或对照。GFP表达细胞百分比±SD(*P（P）= 0.0004). (B类,中部和底部)7天后进行乳房分析和代表性图像（放大倍数：200×），乳房平均数量±SD(*P（P）< 0.0001). (C类,上部)用抗NICD1、抗HES1、抗H3K27me3和抗组蛋白H3探针检测EZH2和EZH2-H689A突变体转导的MCF10A细胞的免疫印迹。(C类,下部)哺乳动物试验。每5×10的平均球体数4第二代电镀细胞±SD(*P（P）≤ 0.0001).
图4。
图4。
EZH2绑定到槽口1良性和乳腺癌细胞中的启动子。(A类)的示意图槽口1在ChIP分析中分析EZH2结合的启动子区域。EZH2在−1.2 kb处与区域“B”结合；随后在该地区进行了实验。(B类)使用qRT-PCR对过度表达全长EZH2、ΔSET、△HII或对照腺病毒的非致瘤原代乳腺细胞进行ChIP分析。侧翼的引信GAPDH公司启动子区是负结合控制区。底漆侧翼第一个多年电价，一种已知的通过H3K27me3直接抑制EZH2转录的靶点，是阳性结合对照。(C类)ChIP分析（如B类)在MDA-MB-231细胞中显示内源性EZH2蛋白结合槽口1发起人。EZH2 KD减少了EZH2绑定。(D类)ChIP分析（如B类)在患者源性乳腺癌细胞中，内源性EZH2蛋白结合槽口1启动子*P（P）< 0.05 (B类和C类). 所有ChIP分析都是三个独立实验的代表。
图5。
图5。
在MMTV-neu小鼠中，转基因乳腺特异性EZH2过度表达上调NOTCH1并加速肿瘤的发生。(A类)16周龄处女EZH2的整群乳腺+;neu和EZH2重量;neu小鼠(n个=每组10只小鼠）。（放大倍数：200×。）三级分支平均数±SD(*P（P）= 0.01). (B类)EZH2乳腺代表性H&E染色组织切片+;neu和EZH2重量;8周龄和16周龄neu小鼠。箭头显示EZH2导管内非典型增生+;neu小鼠。免疫组织化学检测EZH2、NICD1、磷酸化-STAT3（p-STAT3）和Ki-67蛋白。（放大倍数：400×。）条形图显示了使用图像数据集分析框架（FRIDA）软件量化的16周时相对表达±SD的百分比(*P（P）< 0.0004). (C类)Kaplan–Meier曲线表明EZH2+;neu小鼠(n个=30）形成乳腺癌的时间明显早于EZH2重量;neu小鼠(n个=25）（肿瘤开始的中位时间：分别为243天和295天；对数秩P（P）< 0.0001). (D类)EZH2乳腺肿瘤代表性图片+;neu和EZH2重量;neu小鼠H&E染色，EZH2和NICD1免疫染色。（放大倍数：400×。）使用FRIDA软件量化相对表达率±SD(*P（P）< 0.003, **P（P）= 0.009).
图6。
图6。
EZH2过度表达与人类乳腺癌组织中NICD1高和TICs增加相关。(A类)EZH2和NICD1在患者队列中的表达分布(n个= 143) (χ2测试，P（P）< 0.0001). (B类)对人类乳腺癌组织样本进行EZH2和NICD1免疫染色，并对CD44（红色）和CD24（棕色）进行联合免疫染色。病例1为管腔型浸润性癌，EZH2低表达，NICD1和CD44阴性−/CD24型+病例2是TN浸润性癌，具有高EZH2表达和阳性NICD1，并且含有CD44+/CD24型−癌细胞。病例3是一幅典型的乳腺淋巴管肿瘤栓子图片，其EZH2高，NICD1高，并且含有CD44+/CD24型−癌细胞。（放大倍数：400×。）(C类)EZH2一致的浸润性癌百分比高的和NICD1+根据CD44的存在表达+/CD24型−癌细胞(左侧)根据乳腺癌的亚型(赖特). 我们发现EZH2与高的/新生儿重症监护室1+表型和CD44的存在+/CD24型−细胞和TN乳腺癌亚型（χ2测试：P（P）=0.0008和P（P）分别为0.029）。
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