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.2014年3月；28(3):380-94.
doi:10.1210/me.2013-1284。 Epub 2014年2月7日。

TGFBR1是小鼠子宫肌层发育所必需的

杨高 1, Kayla J Bayless公司, 李清雷
附属公司

TGFBR1是小鼠子宫肌层发育所必需的

杨高等。 分子内分泌学. 2014年3月.

摘要

子宫平滑肌层（即子宫肌层）对妊娠和分娩的成功至关重要。我们已经证明，女性生殖道中TGFβ1型受体（TGFBR1）的条件性缺失会导致显著的平滑肌缺陷。本研究旨在明确子宫肌层缺损的细胞和分子基础。我们发现TGFBR1在出生后早期子宫发育期间对子宫肌层的形态和形成是必需的。尽管TGFβ信号转导在血管平滑肌细胞分化中的作用已得到证实，但大多数平滑肌基因在出生后子宫发育期间的Tgfbr1条件敲除（cKO）子宫中的表达水平与对照组相似，与选择平滑肌标记物的蛋白质存在但分布异常相一致。重要的是，这些小鼠的子宫损害了关键细胞外基质蛋白的合成和血小板衍生生长因子的失调表达。此外，血小板衍生生长因子在体外诱导了对照组和Tgfbr1 cKO小鼠子宫基质细胞的迁移。我们的研究结果表明，Tgfbr1 cKO小鼠的子宫肌层缺损可能不是由子宫平滑肌细胞分化的内在缺陷直接引起的，而是与关键细胞外基质成分的生成受损以及出生后子宫发育关键时间窗期子宫细胞异常迁移有关。这些发现可能有助于设计与子宫肌层缺损相关的生殖障碍的新疗法。

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图1。
图1。
子宫肌层缺损Tgfbr1型cKO小鼠在子宫发育早期。CNN1（绿色）在P0（A和B）、P3（C和D）、P5（E和F）、P10（G和H）和P15（I和J）的控制和定位Tgfbr1型cKO小鼠。针对每个时间点（n＝3）显示代表性图像。注意，出生时（P0），对照组和Tgfbr1型cKO小鼠。在P3出现CNN1阳性细胞，在P3检查时子宫平滑肌细胞形成缺陷就出现了。CM，环平滑肌层；LM，纵向平滑肌层。比例尺，20μm。
图2。
图2。
腺生成Tgfbr1型cKO小鼠。A–D，KRT8（绿色）和ACTA2（红色）在对照子宫内的定位Tgfbr1型P5（A和B）和P15（C和D）的cKO小鼠。请注意，在P5子宫腺形成之前，KRT8仅限于子宫腔上皮和表面上皮，并且在子宫内膜破裂层中存在KRT8阳性子宫腺Tgfbr1型第15页的cKO小鼠。E和F，FOXA2（红色）和KRT8（绿色）在对照组子宫中的定位Tgfbr1型第15页的cKO小鼠。G和H，PR（红色）和ACTA2（绿色）在对照子宫中的定位Tgfbr1型第15页的cKO小鼠。针对每组（n＝3）显示了代表性图像。LE，管腔上皮；GE，腺上皮；CM，环状平滑肌层。比例尺，20μm（A、B、E和F）和50μm（C、D、G和H）。
图3。
图3。
TGFβ亚型和TGFBR1在小鼠子宫发育早期表达。A–C，成绩单等级Tgfb1型（A） ，玻璃纤维蛋白2（B） 、和Tgfb3型（C） 出生后子宫发育期间P0（n=5）、P3（n=4）、P5（n=3）、P10（n=4）和P15（n=四）。数据为平均值±SEM.*，P（P）<0.05与P0。D、 的示意图Tgfbr1型拉奇等位基因和X-gal染色。E、 对照组子宫总面积（Ctrl）和Tgfbr1型flox/lacZ公司小鼠经X-gal染色。请注意Tgfbr1型flox/lacZ公司对照组子宫无明显染色。P3（F）、P5（G）和P15（H）小鼠子宫切片的F-H、X-gal染色Tgfbr1型拉奇等位基因（每个时间点n=3-5）。红色虚线表示子宫肌层。黄色虚线表示圆形和纵向平滑肌层之间的边界。注意，X-gal染色的信号随着子宫平滑肌细胞分化的进展而增加。上皮；M、 子宫肌层；LM，纵平滑肌；CM，环状平滑肌。比例尺（20μm）代表性地显示在面板F中。面板F–H中的部分用核固红复染。
图4。
图4。
出生后子宫发育过程中平滑肌标志物/调节物mRNA丰度的发育动态及有条件消融对子宫内膜的影响Tgfbr1型子宫平滑肌细胞的平滑肌基因表达和F-actin细胞骨架。成绩单等级学报2（A） ，行动2（B） ，Cnn1号机组（C） ，胶转蛋白（D） ，设计（E） ，Smtn公司（F） ，我的11（G） 、和Myocd公司（H） 出生后子宫发育期间野生型子宫P0（n=5）、P3（n=4）、P5（n=3）、P10（n=4）和P15（n=四）。一、 对照组子宫平滑肌基因/调节器mRNA的相对水平（n=5）和Tgfbr1型cKO小鼠（n=5）处于P5。注意，平滑肌标记基因的mRNA水平在P10或P15达到最高水平，并且在对照组和Tgfbr1型cKO小鼠除外胶转蛋白显示减少了约30%。数据为平均值±SEM.*，P（P）<0.05 vs P0（A–H）或相应的对照（I）。对照组（J和K）的J–M、F-actin（绿色）和CNN1染色（红色）以及Tgfbr1型cKO（L和M）平滑肌细胞。黄色虚线标记平滑肌细胞。比例尺，20μm。
图5。
图5。
产后早期子宫发育期间IV型胶原和层粘连蛋白mRNA丰度的时间变化。成绩单等级第4a1列（A） ，第4a2列（B） ，第4a3列（C） ，第4a4列（D） ，第4a5列（E） ，第4a6列（F） ，喇嘛2（G） ，喇嘛3（H） ，喇嘛4（一） ，拉马5（J） ，羔羊1（K） ，羔羊2（五十） ，羔羊3（M） ，拉姆1（N） ，灯2（O） 、和Lamc3型（P） 出生后子宫发育期间野生型子宫P0（n=5）、P3（n=4）、P5（n=3）、P10（n=4）和P15（n=四）。请注意，IV型胶原基因在发育过程中受到调节，并在P5时趋于稳定(第4a1列和第4a2列)，第10页(第4a4列，第4a5列，以及第4a6列)，或P15(第4a3列)而大多数层粘连蛋白基因的mRNA表达在P10和P15达到峰值。数据为平均值±SEM.*，P（P）<0.05 vs P0。
图6。
图6。
有条件消融Tgfbr1型在子宫发育早期，减少小鼠子宫中IV型胶原的表达。A–F，P5时对照小鼠子宫中IV型胶原（绿色；A和B）、ACTA2（红色；C和D）、IV型胶原和ACTA2的亚细胞定位（E和F）。G–L，IV型胶原（绿色；G和H）、ACTA2（红色；I和J）以及IV型胶原和ACTA2在子宫内的亚细胞定位Tgfbr1型cKO小鼠处于P5。注意平滑肌细胞中IV型胶原免疫荧光信号减弱Tgfbr1型cKO小鼠（G–L）与对照组（A–F）的比较。每组（n=3）均显示了代表性图像。黄色虚线表示在P5处形成的圆形平滑肌层。CM，环平滑肌层；COL4，胶原蛋白IV。比例尺，20μm。
图7。
图7。
PDGF表达改变Tgfbr1型子宫cKO及其在子宫基质细胞迁移中的作用。A、 相对信使核糖核酸水平Pdgfa公司，Pdgfb公司，Pdgfc公司，以及Pdgfd公司在控制子宫和Tgfbr1型P5的cKO小鼠（每组5只）。Ctrl，control。B、 对照组和对照组PDGFAA蛋白表达的Western blot分析Tgfbr1型cKO小鼠。代表性图像显示在上面板中，下面板显示PDGFAA的相对强度，表示为PDGFAA密度与GAPDH密度的比值（每组3个）。C–F，PDGFRA在对照组（C和D）子宫中的亚细胞定位Tgfbr1型cKO小鼠（E和F）处于P5。G–J，PDGFRB在对照组（G和H）子宫中的亚细胞定位Tgfbr1型cKO小鼠（I和J）处于P5。每组（n=3）显示了面板C–J的代表性图像。请注意，PDGFRA和PDGFRB信号在基质细胞中强烈存在，但在子宫上皮中不存在。LE，管腔上皮；St，基质；肌，子宫肌层。比例尺（20μm）在面板C.K中有代表性地表示，原代子宫基质细胞表达波形蛋白（VIM）。分离的子宫基质细胞培养24小时，并用抗波形蛋白抗体染色。比例尺，20μm。DAPI，4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚。五十、 PDGFAA和PDGFBB诱导对照组和对照组子宫基质细胞迁移Tgfbr1型cKO小鼠。上面板显示了Boyden室分析的代表性图像，下面板显示了三个独立分析的量化数据。数据为平均值±SEM.*，P（P）<0.05 vs相应的控制。
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