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.2014年1月30日；9（1）：e87136。
doi:10.1371/journal.pone.0087136。 2014年电子收集。

胶质母细胞瘤衍生细胞系稳定性的失败：体外自发衰老是主要原因

埃韦利娜·斯托琴斯卡·菲德卢斯 1, 西尔维斯特·皮亚斯科斯基 1, 米查尔·比恩科夫斯基 2, 马特乌斯·巴纳兹奇克 1, Krystyna Hulas-Bigoszewska公司 2, 玛塔·威尼卡·克里梅克 1, 安娜·拉多米亚克·扎卢斯卡 三, 沃尔德马尔·奥赫 4, Maciej Borowiec公司 5, 乔兰塔寨巴 1, 塞萨里·特雷达 1, 彼得罗·里斯克 1
附属公司

胶质母细胞瘤衍生细胞系稳定性的失败：体外自发衰老是主要原因

埃韦琳娜·斯托钦斯卡·菲德鲁斯等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

细胞系分析是癌症研究的重要内容。尽管胶质母细胞瘤细胞培养取得了进展，但从大多数标本中分离出来的细胞不能在体外无限增殖。本研究的目的是确定导致稳定失效的过程。因此，我们分析了56种原代GB培养物，其中7种稳定。我们的结果表明，衰老是胶质母细胞瘤细胞系稳定失败的主要原因，而有丝分裂突变和凋亡起次要作用。此外，一种新的技术方法可以对原代培养物中的衰老细胞进行更深入的分析，包括肿瘤细胞和正常细胞之间的区别。此外，我们观察到原代培养的胶质母细胞瘤细胞具有不同的体外自发衰老潜能，这通常高于浸润肿瘤的正常细胞。因此，这是第一次在原代细胞培养（包括单层细胞和球形细胞）中发现GB细胞迅速自发衰老的报道。有趣的是，我们的数据还表明，近一半的GB细胞系同时存在TP53突变和CDKN2A纯合缺失，这在胶质母细胞瘤中被认为是互斥的。此外，对胶质母细胞瘤细胞衰老和有丝分裂突变机制的认识可能是朝着潜在的新治疗方法迈出的一步。

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数字

图1
图1。胶质母细胞瘤细胞分子分析的典型结果。
（A） 一个典型的FISH结果显示了7号染色体的多聚体（矩形放大的单个细胞）；表皮生长因子受体探头（红色信号）；CEP 7控制探头（绿色信号）；放大1000倍；（B） 堪称典范TP53型测序结果表明，该序列标记了密码子237的突变核苷酸；（C，D）MLPA示例结果显示（C）遗传改变(表皮生长因子受体和MDM4型扩增）在经典条件下培养的细胞早期传代中，以及（D）在同一肿瘤细胞的晚期传代中没有扩增。
图2
图2。肿瘤细胞过度生长细胞的免疫细胞化学鉴定。
（A） 经典单层细胞培养的晚期传代。表达αSMA的大多数细胞是GFAP（−）。也可见少量GFAP（+）/α-SMA（−）细胞；（B） 细胞从球形核心径向侵入，进一步生长为单层。观察到三个群体：GFAP阳性；αSMA阳性和双阴性。
图3
图3。胶质母细胞瘤细胞培养的细胞生物学特征比较。
分别描述了不同培养条件下细胞的特征：来自提供稳定细胞系的培养物的肿瘤细胞（蓝色条）、来自没有提供细胞系的细胞培养物的瘤细胞（红色条）和来自后一种培养物的正常细胞（绿色条）。（A） 胶质母细胞瘤细胞培养中肿瘤细胞含量的差异；（B） 7天孵育期间合并BrdU的细胞百分比的比较；（C） 衰老（SA-β-Gal阳性）细胞百分比的比较；（D） Mann-Whitney U检验的结果。经典条件下血清E–p0-p3（1-3周）；Ser L–p6-p13（8-16周）在经典条件下；无血清单层条件下的SF E–p0-p1（1–3周）；无血清单层条件下的SF L–p3-p5（6–16周）；Sph E–t0-t2（最多3周）球状体培养；Sph L–t4-t8（3-5个月）球状体培养；E——早期通道/传输；L–迟通过/转移；T肿瘤细胞，表达TP53或EGFR和GFAP；N——正常细胞；s–培养基提供稳定的细胞系，u–培养基不提供稳定细胞系。
图4
图4。不同GB-衍生细胞培养物中免疫细胞化学BrdU联合染色的示例结果。
（A，B）与BrdU孵育7天后，在经典单层条件下培养的细胞早期传代。在这两种情况下，可检测到两组细胞：（A）BrdU（+）/EGFR（−）/GFAP（−；（B） BrdU（+）/TP53（−）/GFAP（−；（C） 与BrdU孵育5天后，在无血清条件下培养的细胞早期传代，TP53（+）/GFAP（+）肿瘤细胞对BrdU呈阴性；（D） 来自2的球体第与BrdU孵育7天后转移，大多数细胞为BrdU阳性；（E） 从球体核心径向侵入的细胞（2第转移）。大多数EGFR（+）/GFAP（+）细胞含有BrdU；（F） 培养2个月后从球状核侵入的细胞。少于10%的细胞含有BrdU（培养10天）。
图5
图5。酶细胞化学染色显示在不同条件下培养的胶质母细胞瘤细胞的衰老。
在所有测试条件下均观察到SA-β-Gal阳性细胞。（A） 单层血清条件下GB细胞的早期传代；（B） 单层血清条件下GB细胞的晚期传代；（C） 单层无血清条件下GB细胞的晚期传代；（D） 早期球体中的细胞；（E） 晚期球体中的细胞；（F） 晚期漂浮球体中的细胞。
图6
图6。免疫细胞化学和酶细胞化学相结合证实了肿瘤细胞的衰老。
（A，B）在经典条件下培养的细胞的晚期传代。只有GFAP阳性细胞显示SA-β-Gal活性；（C，D）在经典条件下培养的细胞的晚期传代。只有TP53（+）/GFAP（+）细胞显示SA-β-Gal活性。
图7
图7。通过两种方法（BrdU掺入法和SA-β-Gal法）验证肿瘤细胞衰老。
（A–C）只有两种细胞群可见：BrdU（−）/SA-β-Gal（+）/TP53（+）和BrdU。
图8
图8。胶质母细胞瘤细胞的实时显微镜监测。
在9天的观察期间（36小时内拍摄的图像），细胞生长并伸长，但没有增殖。
图9
图9。免疫细胞化学和酶细胞化学相结合证实了具有干细胞特征的胶质母细胞瘤细胞的衰老。
（A，B，C）在经典条件下培养的细胞的早期传代。SOX2阳性细胞显示SA-β-Gal活性，不含BrdU；（D，E，F）在经典条件下培养的细胞的早期传代。巢蛋白阳性细胞显示SA-β-Gal活性。
图10
图10。胶质母细胞瘤细胞系稳定失败的其他机制示例。
（A，B）具有有丝分裂突变特征的肿瘤细胞（有两个核的大平面细胞）：GFAP（A）和EGFR（B）阳性；具有凋亡特征的（C，D）GFAP阳性细胞；（E，F）TP53阳性细胞，显示神经衰弱特征；可见核萌芽，只有一部分微核呈BrdU阳性。
图11
图11。来自球形培养物的胶质母细胞瘤细胞的侵袭能力。
（A，B）GB细胞形成晚期球状体转移，球状体侵入Matrigel-coated滤过器至侵入室滤过器下表面，SA-β-Gal活性（A）和DAPI（B）染色。（C） Box-whisker图（平均值、标准误差和最小/最大值）显示了球体早期和晚期转移的侵袭SA-β-Gal（+）和SA-β-Gal（−）细胞的百分比。统计分析结果（使用Mann-Whitney U检验）分别针对每种情况和累积组显示在下表中。
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出版物类型

物质

赠款和资金

这项研究由国家科学中心2011/03/N/NZ1/06534号拨款（衰老分析）和波兰制药科学基金会（其他分析）赞助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。