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.2014年4月；10(4):603-17.
doi:10.4161/auto.27722。 Epub 2014年1月17日。

自噬在NAD生物合成抑制剂APO866抗白血病/淋巴瘤作用中的关键作用

瓦妮莎·吉奈 1, 朱利安·普亚尔 1, Coralie Rummel公司 1, 多米尼克·奥布里 2, 卡罗琳·布莱顿 2, 安妮·朱莉·克鲁斯 2, Somi R Majjigapu公司 三, 伯纳德·索达特 三, 皮埃尔·沃格尔 三, 桑蒂娜火山灰 4, 阿莱西奥·内西奥尼 5, 米歇尔·杜舒瓦尔 2, 瞄准Nahimana 2
附属公司

自噬在NAD生物合成抑制剂APO866抗白血病/淋巴瘤作用中的关键作用

瓦妮莎·吉奈等。 自噬. 2014年4月.

摘要

APO866是一种NAD生物合成抑制剂，在各种恶性肿瘤中表现出强大的抗肿瘤特性。最近，有研究表明APO866可诱导人类血液肿瘤细胞的凋亡和自噬，但自噬在APO866-诱导的细胞死亡中的作用尚不清楚。在这里，我们报道了APO866诱导细胞死亡的分子机制研究，重点是自噬。APO866治疗白血病和淋巴瘤细胞既可诱导自噬，如自噬体形成和SQSTM1/p62降解增加所示，也可增加caspase活化，如CASP3/caspase 3裂解所示。作为一种潜在机制，APO866介导的自噬被发现会耗尽CAT/过氧化氢酶（一种活性氧（ROS）清除剂），从而促进ROS的产生和细胞死亡。通过ATG5或ATG7沉默抑制自噬可阻止CAT降解、ROS生成、caspase激活和APO866诱导的细胞死亡。最后，补充外源性CAT也能消除APO866的细胞毒活性。总之，我们的结果表明，自噬对于APO866对血液恶性肿瘤细胞的细胞毒活性至关重要，同时也表明自噬依赖性CAT降解，这是APO866-介导的细胞杀伤的一种新机制。自噬调节方法可能是增强APO866及其相关药物抗肿瘤活性的新途径。

关键词：APO866；自动液位计；目录酶；北美地区；活性氧；自噬；白血病；淋巴瘤；治疗。

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数字

无
图1。APO866诱导Jurkat细胞自噬。(A类)Western blot分析和在不同时间点用APO866（10 nM）处理的未处理对照细胞（ct）和Jurkat细胞中LC3-II型的相应定量。n≥7。(B类)免疫标记LC3（红色）和Hoechst染色（细胞核）的Jurkat细胞的共焦图像，每µm细胞中LC3阳性点（自噬体）数量的量化2在不同时间点接触APO866后。比例尺：10µm。n=每种条件下40个电池。(C类)未处理的对照细胞和用APO866（10nM）处理的Jurkat细胞中不同时间点的SQSTM1蛋白的蛋白质印迹分析和相应定量。n≥5。(D类)在存在溶酶体抑制剂CQ和/或APO866的情况下，对未经处理的对照细胞和处理的Jurkat细胞中的LC3-II型进行Western blot分析和相应定量。在APO866（10 nM）治疗72小时之前，用25µM预处理Jurkat细胞1小时，以评估APO866-诱导的自噬形成。n≥5。数据为平均值±SD**对<0.01***对< 0.001.
无
图2。APO866激活Jurkat细胞中的半胱天冬酶。(A类)在未处理的对照细胞（ct）中以及在APO866（10nM）处理后的不同时间点对CASPASE 3（CASP3）的19和17kDa片段进行蛋白质印迹和相应定量。数据为平均值±SD，n≥5***对< 0.001. (B类)荧光激活半胱天冬酶的检测。用10 nM APO866处理Jurkat细胞72 h，并使用每个caspase的荧光特异性探针和流式细胞术检测激活形式的CASP3、CASP8和CASP9。数据代表至少3个独立实验。
无
图3。BECN1、ATG7和自动液位计5在Jurkat细胞中有效下调。用慢病毒载体稳定地转导Jurkat细胞，该慢病毒载体可传递对照扰乱（sc）shRNA或靶向shRNABECN1公司,自动液位计5、和自动液位计7.BECN1的Western blot分析和相应定量(A类)和ATG7(B类)蛋白质表达水平或Q-RT-PCR检测自动液位计5信使核糖核酸(C类)以确认下调的效率。数据为平均值±SD，n=6**对<0.01***对< 0.001.
无
图4。ATG7和ATG5下调可防止APO866诱导Jurkat细胞自噬。(A类)靶向干扰shRNA（sc）或shRNAs稳定转导的Jurkat细胞中LC3-II的Western blot分析和相应定量BECN1公司,自动液位计5、和自动液位计7并用APO866（10 nM）处理24小时和48小时或未处理（ct）。n≥4。(B类)经APO866（10 nM）处理72 h后，转导细胞中SQSTM1的Western blot分析和相应定量。n≥9。数据为平均值±标准差*对< 0.05, **对<0.01***对< 0.001. NS=无显著性。
无
图5。APO866诱导的细胞死亡需要自噬。APO866对Jurkat细胞的细胞毒性，无论是野生型（WT）还是靶向干扰型（sc）shRNA或shRNAs的慢病毒转导BECN1公司,自动液位计5、和自动液位计772小时后细胞死亡(A类)和240小时(C类)APO866（10 nM）治疗以及72小时药物暴露后的细胞生长(B类)使用ANXA5和7-氨基放线菌素D（7AAD）染色和台盼蓝排斥试验通过流式细胞术进行评估。早期凋亡细胞百分比（ANXA5+公元7年−)或活细胞（未经台盼蓝染色）呈白色柱状，晚期凋亡细胞（ANXA5+公元7年+)或死亡（台盼蓝染色）细胞显示为实心黑色柱。数据为平均值±SD，n≥3***对< 0.001.
无
图6。自噬有助于APO866诱导Jurkat细胞中CASP3激活。(A类)在胰蛋白酶抑制剂zVAD.fmk（100µM）存在下，APO866（10 nM）对Jurkat细胞诱导细胞死亡的时间进程分析。细胞死亡的评估如图5所示。数据为平均值±SD，n≥3**对<0.01（与APO866处理的细胞相比）。(B类)用扰乱（sc）shRNA或shRNA靶向慢病毒转导的Jurkat细胞中切割的CASP3的蛋白质印迹分析和相应的定量BECN1公司,自动液位计5、和自动液位计7暴露于APO866（10 nM）72 h。数据为平均值±SD，n≥10*对< 0.05, ***对< 0.001.
无
图7。APO866诱导Jurkat细胞产生ROS和CATALASE（CAT）降解。(A类)检测用APO866（10 nM）处理72 h的Jurkat细胞中的ROS生成。分别使用DHE、MitoSOX和DCFDA荧光探针通过流式细胞术检测细胞溶胶、线粒体超氧化物和过氧化氢。数据为平均值±SD，n≥3。(B类)Western blot分析和不同时间点未经处理（ct）和经APO866（10 nM）处理的野生型Jurkat细胞CAT表达的相应定量。数据为平均值±SD，n≥9*对< 0.05, **对<0.01***对< 0.001.
无
图8。自噬是APO866诱导Jurkat细胞产生活性氧的关键因素。靶向干扰shRNA（sc）或shRNAs稳定转导Jurkat细胞ROS生成的检测BECN1公司,自动液位计5、和自动液位计7并在不同时间点用APO866（10 nM）处理。线粒体超氧化物(A类)和过氧化氢(B类)采用MitoSOX和DHE进行流式细胞术检测。数据为平均值±SD，n≥3***对<0.001（与APO866处理的sc-shRNA-转导细胞相比）。
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图9。自噬参与APO866诱导Jurkat细胞CAT降解。(A类)靶向打乱（sc）shRNA或shRNAs慢病毒转导的Jurkat细胞CAT表达的Western blot分析和相应定量BECN1公司,自动液位计5、和自动液位计7暴露于APO866（10 nM）72 h。数据为平均值±SD，n≥8***对< 0.001. (B类)靶向sc-shRNA或shRNAs转导Jurkat细胞线粒体膜电位（MMP）的检测BECN1公司,ATG5，或自动液位计7，并暴露于APO866（10 nM）72 h。如材料和方法所述，使用JC-1和流式细胞术染色红色与绿色荧光测定MMP。数据为平均值±SD，n≥3***对< 0.001.
无
图10。细胞外添加CAT可防止各种造血恶性细胞系中APO866介导的细胞死亡。在存在或不存在APO866（10 nM）的情况下，用CAT（500或1000 U/ml）培养细胞。评估细胞死亡(A类)72小时和(B类)药物暴露后168小时，如图5所示。数据来自至少3个独立实验。
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图11。外源性添加CAT可消除APO866诱导的患者各种原发性造血恶性细胞的细胞死亡。在存在或不存在APO866（10 nM）的情况下，用或不存在CAT（500 U/ml）培养细胞。如图5所示，在药物暴露72小时后评估细胞死亡。
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