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.2014年5月；32(5):1347-60.
doi:10.1002/stem.1648。

追踪难以捉摸的纤维细胞：小鼠伤口愈合过程中产生胶原蛋白的造血细胞的鉴定和表征

Hirotaka Suga公司 1, 罗伯特·伦内特, 梅兰妮·罗德里格斯, 索尔金, 杰森·格洛茨巴赫, 迈克尔·贾努西克（Michael Januszyk）, 藤原俊弘, 迈克尔·T·朗克, 杰弗里·古特纳
附属机构

追踪难以捉摸的纤维细胞：小鼠伤口愈合过程中产生胶原蛋白的造血细胞的鉴定和表征

Hirotaka Suga公司等。 干细胞. 2014年5月.

摘要

据报道，纤维细胞是一种独特的循环细胞群，具有造血细胞和间充质细胞的特性，在伤口愈合中发挥着重要作用。然而，已发现推测的纤维细胞在分化过程中失去造血表面标记物（如CD45）的表达，这使得用传统方法在体内追踪这些细胞变得困难。在本研究中，为了区分没有表面标记的造血细胞和非造血细胞，我们利用vav 1基因，该基因仅在造血细胞上表达，而在其他细胞类型上不表达，并建立了一种新型转基因小鼠，其中造血细胞被不可逆地标记为绿色荧光蛋白，非造血细胞被标记为红色荧光蛋白。在该小鼠模型中使用单细胞转录分析揭示了两种离散类型的I型胶原（Col I）表达细胞的造血谱系招募到切除性皮肤伤口中。我们在蛋白质水平上证实了这一发现，其中一个Col I合成细胞亚群是CD45+和CD11b+，符合纤维细胞的传统定义，另一个是CD45-和CD11b-，代表一个先前未确认的人群。发现这两种细胞类型最初达到峰值，然后减少愈合后，这与伤口部位的消失一致，而不是失去识别表面标记物的表达。综上所述，我们明确地确定了两种造血来源的细胞，它们被招募到伤口部位并沉积胶原蛋白，明确证实了皮肤愈合过程中纤维细胞的存在和自然时间过程。

关键词：胶原蛋白；纤维细胞；造血细胞；表面标记；伤口愈合。

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作者表示没有潜在的利益冲突。

数字

图1
图1
VavR双转基因小鼠在造血细胞表达GFP，在非造血细胞表达RFP。（A） ：在mTmG小鼠与Vav-Cre杂交时，子代中表达Vav 1（造血）的所有细胞因loxP位点的分裂而排除RFP，而是表达GFP。不表达vav 1（非造血）的细胞仍为RFP+。（B） ：野生型小鼠外周血细胞的流式细胞术是非荧光的，而VavR小鼠的GFP+是无荧光的。在VavR小鼠的外周血中未检测到循环RFP+细胞。（C） 以下为：脾脏、肝脏、心脏和皮肤的组织学图像显示RFP和GFP细胞的分布。细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚染色。比例尺=75μm。（D） ：从VavR小鼠的心脏、脾脏、肝脏和皮肤中分离的细胞的流式细胞术显示了这些器官中GFP+和RFP+细胞的相对比例。（E、F）：脾脏（E）中CD45和皮肤（F）中细胞角蛋白的免疫组织化学显示CD45（紫色）与GFP共定位，细胞角蛋白（紫色）和RFP共定位。白色箭头突出显示了协同本地化区域。灰色箭头显示脾脏中有少量GFP+/C45−细胞，表明CD45不是造血谱系细胞的普遍标记。灰度条=75μm。白色比例尺=150μm。缩写：GFP，绿色荧光蛋白；RFP，红色荧光蛋白。
图2
图2
VavR双转基因小鼠的骨髓细胞主要是GFP+，但显示出RFP+骨髓间充质干/祖细胞（BMSCs）。（A） ：对整个VavR骨髓进行流式细胞术分析，不去除血统，显示可忽略不计的RFP+细胞。大多数GFP+细胞是CD45+（相对于GFP+总细胞的百分比）。（B、C）：GFP+骨髓细胞的流式细胞术分析表明，GFP+/CD45-细胞没有显示单核细胞CD11b+或巨噬细胞F4/80+的标记物（相对于总GFP+细胞的百分比）。（D） ：骨髓细胞的谱系缺失可以检测到RFP+细胞，其中一部分对BMSC标记物Sca-1呈阳性（相对于总RFP+电池的百分比）。（E） ：体外培养骨髓细胞会增加RFP+细胞在传代过程中的患病率。比例尺=50μm。缩写：GFP，绿色荧光蛋白；RFP，红色荧光蛋白。
图3
图3
在VavR双转基因小鼠的伤口愈合过程中，造血细胞和非造血细胞得到了很好的区分。（A、B）：伤口愈合过程中的组织学图像和量化显示GFP+造血细胞在第7天达到峰值，而RFP+非造血细胞在14天达到峰值。比例尺=50μm。量化包括每个高功率场（hpf）的RFP+和GFP+电池数量。（C） ：流式细胞术显示伤口中的大多数GFP+细胞是CD45+（相对于GFP+总细胞的数量）。（C–E）：通过流式细胞术（C）（相对于RFP+细胞总数的百分比）和免疫染色的定量（D，E），发现RFP+/CD31+内皮细胞在伤口中在第14天达到峰值。蓝色：CD31。白色箭头突出显示RFP/CD31共同定位的区域。比例尺=100μm。值得注意的是，（C）中的RFP和GFP百分比是相对数值（即RFP计数与RFP+GFP计数），并不反映绝对单元格数的变化。缩写：GFP，绿色荧光蛋白；RFP，红色荧光蛋白。
图4
图4
单核细胞/巨噬细胞系细胞是伤口的主要招募人群。（A，B）：第7天F4/80（蓝色）的标准和三维免疫组织化学成像显示伤口中的F4/80+细胞与GFP+和CD45+（紫色）细胞共定位。白色刻度条=40μm；灰度条=20μm。白色箭头突出显示GFP+/CD45+/F4/80+协同定位区域。（C） ：伤口裂解液的流式细胞术显示GFP+/CD11b+/F4/80+细胞分数（相对于总细胞的百分比）在第7天达到峰值，并在第28天恢复到基线水平。缩写：GFP，绿色荧光蛋白；RFP，红色荧光蛋白。
图5
图5
单细胞转录分析揭示了单核细胞/巨噬细胞谱系细胞及其胶原蛋白表达在伤口愈合中的重要性。（A） ：伤口中绿色荧光蛋白+细胞的部分聚集。列表示单个细胞，行对应于基因。黄色表示表达增加，蓝色表示表达减少。单核细胞/巨噬细胞谱系细胞的特征是CD11b（Itgam）和F4/80（Emr1）的高表达，并表达I型和III型胶原。（B） ：创伤后第7天，伤口中表达I型胶原的单核细胞/巨噬细胞的相对百分比显著增加，并在随后的时间点缓慢回归到基线水平（相对于Col I+单核细胞和巨噬细胞总数的百分比）。（C） ：散点图表示I型胶原表达和表面标记物之间的相关性。在表达I型胶原的造血细胞中，CD45和CD11b的表达存在异质性。
图6
图6
确定了两个造血衍生纤维细胞群体：GFP+/CD45+/CD11b+/Col I+和GFP+/CD45-/CD11b−/Col I+。（A） ：免疫组织化学证实存在沉积I型胶原的单核细胞/巨噬细胞亚群。紫色：胶原蛋白I，蓝色：F4/80。比例尺=20μm。（B） ：免疫印迹显示创伤后第7天造血谱系（GFP+）Col I产生细胞的募集，正常皮肤中没有这种细胞类型。创伤后基质细胞（RFP+）Col I生成也增加。（C） ：流式细胞术分析表明，GFP+/CD45+/CD11b+/Col I+细胞被招募到伤口，在第7天达到峰值，到第28天数量减少（基于总GFP+细胞的百分比）。（D） ：第二种，非单核细胞造血细胞亚群（GFP+/CD45−/CD11b−/Col I+）沉积I型胶原并显示类似的招募模式，也通过流式细胞术进行了鉴定（基于总GFP+细胞的百分比）。缩写：GFP，绿色荧光蛋白；RFP，红色荧光蛋白。
图7
图7
SDF-1型α导致骨髓源性CD11b+细胞迁移，TGF-β1调节CD11b+细胞中的基因表达α肌成纤维细胞标记物SMA在体内浸润伤口的造血细胞亚群中得到证实。（A） ：VavR骨髓的原代培养物为MACS，分选CD11b并重新培养。免疫荧光证实细胞为GFP+/CD11b+。蓝色：CD11b。比例尺=50μm。（B） ：SDF-1趋化性测定α、MCP-1和TGF-β1显示CD11b+细胞迁移以响应SDF-1α，带有*，第页与对照组相比<0.05(n个=4).（C） ：SDF-1型α、MCP-1和TGF-β1 CD11b+细胞治疗显示TGF-β1上调纤维化相关基因（I型胶原，αSMA和TIMP-1）和血管内皮生长因子（通过qPCR.*），第页与对照组相比<0.05(n个=4).（D） ： αSMA在伤口早期的时间点在浸润的造血细胞亚群中表达，但随着伤口的愈合而消退。白色箭头突出显示以下区域αSMA/GFP协同定位。白色刻度条=75μm；灰度条=40μm。缩写：αSMA，平滑肌肌动蛋白；绿色荧光蛋白；RFP，红色荧光蛋白；金属蛋白酶组织抑制剂TIMP-1；血管内皮生长因子。
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