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.2014年1月16日；5（1）：e999。
doi:10.1038/cddis.2013.530。

人多巴胺能神经元中SK通道的亚细胞表达及神经保护作用

A M多尔加 1, 安德拉德 2, L迈斯纳 三, H-G可耐斯 4, Möllerhage公司 5, P克里斯托弗森 6, H齐施卡 7, N普列斯尼拉 三, G U Höglinger先生 5, C卡尔姆塞 1
附属机构

人多巴胺能神经元中SK通道的亚细胞表达及神经保护作用

A M多尔加等。 细胞死亡病. .

摘要

小电导Ca（2+）激活的K（+）通道激活是一种新兴的治疗神经疾病的方法，包括中风、肌萎缩侧索硬化和精神分裂症。我们以前的研究表明，激活SK通道通过抑制NMDAR介导的兴奋毒性发挥神经保护作用。在本研究中，我们测试了NS309（25μM）的SK通道激活对体外培养的人类有丝分裂后多巴胺能神经元的治疗潜力，这些神经元有条件地永生化并从人类胎儿中脑细胞分化而来。定量RT-PCR和western blotting分析显示，分化的多巴胺能神经元表达低水平的SK2通道，高水平的SK1和SK3通道。此外，亚细胞组分的蛋白质分析揭示了SK2通道亚型在线粒体富集组分中的表达。线粒体复合物I抑制剂鱼藤酮（0.5μM）破坏人类多巴胺能神经元的树突状网络并诱导神经元死亡。激活SK通道降低线粒体膜电位，同时保留鱼藤酮激发后的树突状网络、细胞活力和ATP水平。通过增加和/或稳定SK通道活性，可以防止线粒体功能障碍和延迟多巴胺能细胞死亡。总之，我们的研究结果表明，激活SK通道可能通过激活膜和线粒体SK通道对人类多巴胺能神经元产生保护作用。因此，SK通道有望成为神经退行性疾病（如帕金森病）的治疗靶点，帕金森病的多巴胺能细胞丢失与疾病进展相关。

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数字

图1
图1
SK通道在LUHMES神经元中表达。人LUHMES多巴胺能神经元分化6天。SK通道亚型的表达通过(一)qPCR(b)RT-PCR（SK1通道被描绘为KCNN1，SK2通道被描绘成KCNN2，SK3通道被描绘成为KCNN3，用于mRNA水平）和(c（c）)西方印迹法。作为负载对照，GAPDH、肌动蛋白（在mRNA水平上被描述为ACTB）和亲环素B（在mRNA水平上被描述为PPIB）被显示
图2
图2
多巴胺能神经元在鱼藤酮刺激下发生细胞死亡。(一)鱼藤酮（0.1–2）处理的LUHMES多巴胺能神经元的细胞活力 μM） 24小时 h（白色条）或48 h（黑条）通过MTT分析进行研究。(b)在鱼藤酮激发24小时后分析ATP生成 h（白色条）或48 h（黑色条）。(c（c）)用NS309（1–100）处理LUHMES多巴胺能细胞 μM） 24小时 h，并通过MTT细胞活性测定进行分析。(*P（P）<0.05,#P（P）<0.05, ***P（P）<0.001与未经处理的多巴胺能细胞，ANOVA Scheffés检验，n个=每组6孔，实验重复三次）
图3
图3
激活SK通道可防止鱼藤酮诱导的神经细胞死亡和网络解体。多巴胺能细胞用鱼藤酮（0.5 μM） 无论是否有NS309（25 μM） ●●●●。(一)未处理或处理24小时的多巴胺能细胞的代表性显微镜照片和DAPI染色 h，鱼藤酮（0.5 μM） 和NS309（25 μM） ●●●●。(b)DAT免疫染色显示神经元网络。使用Image J软件和Neurite Tracer插件（条形图：20 μm） ●●●●。(c（c）)根据DAT免疫染色和DAPI染色细胞核所覆盖的总面积评估神经元网络解体（描述为神经元网络）的分析。柱状图显示了对n个=每个条件9–10个字段，n个=3, **P（P）<0.01与未经处理的多巴胺能神经元，#P（P）<0.05与鱼藤酮处理的多巴胺能神经元（ANOVA Scheffé’s test）。(d日)通过计算DAPI阳性核和碎片化或致密化DAPI阳性细胞核的总数来评估核损伤。条形图显示了碎片DAPI的百分比与总DAPI染色(**P（P）<0.001与未经处理的多巴胺能神经元，###P（P）<0.001与鱼藤酮处理的多巴胺能神经元，ANOVA Scheffé测试，n个＝500个细胞/条件，n个=4). (e（电子）和（f）)多巴胺能细胞被鱼藤酮（0.5 μM） 无论是否有NS309（25 μM） 和阿帕明（10-20 μM） ●●●●。NS309介导的神经保护对鱼藤酮毒性的分析(e（电子）)MTT分析和(（f）)ATP检测（无显著性数据显示为NS**P（P）<0.01, ****P（P）<0.0001与鱼藤酮处理的多巴胺能神经元，ANOVA Scheffé测试，n个=每组6孔，实验重复三次，结果相似）
图4
图4
鱼藤酮改变SK通道的表达。鱼藤酮刺激多巴胺能细胞（0.5 μM） 无论是否有NS309（25 μM） 对于24 研究h对SK通道表达的影响。SK通道亚型的表达通过(一–c（c）)qPCR（SK1通道被描绘为KCNN1，SK2通道被描绘成KCNN2，SK3通道被描绘成为KCNN3，用于mRNA水平）和(d日–（f）)西方印迹法。用SK1抗体检测全蛋白裂解物的免疫检测(d日)库存2(e（电子）)和SK3(（f）)通道和肌动蛋白作为负载控制。上部面板显示SK1(d日)，库存2(e（电子）)或SK3(（f）)通道表达，下部面板显示相应的肌动蛋白表达。SK通道蛋白印迹带的密度分析（以非处理对照细胞的百分比表示为“集成光密度”）表明，鱼藤酮处理可诱导SK2通道的下调和SK3通道的上调（无显著性数据显示为NS*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001, ****P（P）<0.0001与未经处理的多巴胺能神经元，#P（P）<0.05,##P（P）<0.01,####P（P）<0.0001与鱼藤酮处理的多巴胺能神经元，ANOVA Scheffé测试，n个=3)
图5
图5
线粒体中存在SK2通道(一)使用抗体对全细胞提取物（描述为“细胞”）、胞浆上清液（描述为‘细胞’）或粗线粒体颗粒（描述为'Mito’）进行免疫印迹分析(一)SK1中(b)SK2和(c（c）)SK3通道和蛋白质定位的控制抗体（COX IV线粒体基质，Tubulin-cytosol）。(d日)人类多巴胺能细胞中SK1、SK2和SK3通道的共焦图像。使用特定线粒体标记MitoTracker Deep Red（条形图：5）进行线粒体染色 μm） ●●●●。(e（电子）)多巴胺能细胞与SK（SK1/SK2/SK3）通道和MitoTracker深红色的定量共定位分析(（f）)由LAS AF软件（Leica）处理的用于共定位分析的采集图像的图像生成散点图。计算细胞体ROI处共定位率的平均百分比。共定位率平均值：MitoTracker/SK1:34.1%，MitoTracher/SK2:86.1%，MitoTracker/SK3:26.7%。共定位率：该值以百分比表示共定位的程度。它由共定位荧光信号的面积与图像前景的面积之比（Obs.ROI：感兴趣区域）计算得出
图6
图6
激活SK通道可防止钙调节异常。(一)研究了在存在或不存在SK通道开放剂NS309的情况下，用有毒浓度的鱼藤酮攻击多巴胺能细胞的细胞内钙(*P（P）<0.05,与ANOVA Scheffés检验，鱼藤酮和NS309处理的多巴胺能神经元被认为是显著的，n个=6). (b)基质金属蛋白酶的变化（ΔΨ米)采用DIOC6（3）荧光检测法检测。隔离25-50 μg线粒体与20 nM DIOC6（3）染料。作为ΔΨ完全损失的积极控制米，CCCP（50 μM） 原核生物被施加在完整的线粒体上。ΔΨ米由FLUOstar Optima荧光板阅读器使用485/520-nm滤波器进行激发/发射分析
图7
图7
ΔΨ米被SK频道打开所改变。分离线粒体(一,c（c）,e（电子）)小鼠大脑和突触体(b,d日,（f）)用荧光染料罗丹明123（被描述为Rh123）和ΔΨ米已测量。NS309效应的代表性Rh123荧光痕迹（25 μM） 关于分离的线粒体(一和b)在缺乏细胞外钙的情况下(c（c）和d日)在10人在场的情况下 μM钙2+和(e（电子）和（f）)第页，共40页 μM钙2+作为ΔΨ完全损失的积极控制米，FCCP（50 μM） 原核生物被施加在完整的线粒体上
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