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.2014年3月；34(6):1100-20.
doi:10.1128/MCB.00420-13。 Epub 2014年1月13日。

p53/microRNA34a/sirtuin 1通路的c-Jun N末端激酶1/c-Jun激活参与脱氧胆酸诱导大鼠肝细胞凋亡

Duarte M S费雷拉 1, 玛尔塔·B·阿方索, 佩德罗·M·罗德里格斯, 安德烈·西蒙, 黛安·佩雷拉, 佩德罗·博拉略, 塞西利亚·M·P·罗德里格斯, 鲁伊·E·卡斯特罗
附属公司

p53/microRNA34a/sirtuin 1通路的c-Jun N末端激酶1/c-Jun激活参与脱氧胆酸诱导大鼠肝细胞凋亡

Duarte M S费雷拉等。 分子细胞生物学. 2014年3月.

摘要

微RNA（miRs）与代谢性肝病的关系越来越密切。我们已经证明，熊去氧胆酸是一种亲水性胆汁酸，可以对抗非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者肝脏中激活的miR-34a/sirtuin 1（SIRT1）/p53通路。相反，疏水性胆汁酸，尤其是脱氧胆酸（DCA），激活细胞凋亡，并在NASH中增加。我们评估了DCA诱导的大鼠肝细胞凋亡是否通过miR-34a依赖性途径发生，以及是否与c-Jun N末端激酶（JNK）诱导有关。DCA以剂量和时间依赖性的方式增强miR-34a/SIRT1/p53促凋亡信号。反过来，miR-34a抑制和SIRT1过度表达显著挽救了DCA对miR-34a通路的靶向作用和细胞凋亡。此外，p53过度表达激活了miR-34a/SIRT1/p53通路，DCA进一步诱导了该通路。DCA增加了PUMA和miR-34a本身的p53表达以及p53转录激活，为miR-34a激活提供了一种功能机制。JNK1和c-Jun被证明是p53上游DCA参与miR-34a通路和凋亡的主要靶点。最后，JNK1/miR-34a促凋亡电路的激活也在大鼠肝脏中发生。这些结果表明，JNK1/p53/miR-34a/SIRT1通路可能是开发新药以阻止代谢和凋亡相关肝脏病变的一个有吸引力的药理靶点。

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数字

图1
图1
DCA以剂量依赖性方式诱导原代大鼠肝细胞凋亡和miR-34a/SIRT1/p53通路。按照材料和方法中的描述分离细胞，并用10至400μM DCA或不添加（对照）处理细胞24小时（A）MTS代谢。（B） LDH活性。（C） miR-34a的Northern blot（顶部）和实时RT-PCR（底部）分析。显示了一个具有代表性的斑点。为总RNA输入对斑点进行归一化。（D） SIRT1和乙酰基p53（Ac-p53）的免疫印迹。显示了具有代表性的免疫印迹。斑点分别归一化为内源性β-肌动蛋白或总p53。结果表示为至少4个独立实验的平均（±平均值标准误差）折叠变化。§,P（P）<0.05，和*，P（P）<0.01，来自对照组。
图2
图2
DCA不调节原代大鼠肝细胞中miR-195、-200a、-143、-145和-122的表达。按照材料和方法中的描述分离细胞，并用10至400μM DCA或不添加（对照）处理细胞24小时。miR-195（A）、miR-200a（B）、miR 143（C）、miR145（D）和miR-122（E）的Northern blot分析（顶部）和实时RT-PCR分析（底部）。显示了具有代表性的斑点。为总RNA输入对斑点进行归一化。结果表示为至少3个独立实验的平均（±平均值标准误差）折叠变化。§,P（P）<0.05，和*，P（P）<0.01，来自对照组。
图3
图3
DCA以时间依赖性的方式诱导原代大鼠肝细胞凋亡和miR-34a/SIRT1/p53通路。按照材料和方法中的描述分离细胞，并用100μM DCA或不加DCA（对照）处理16、28、40、52和64小时（A和B）。使用ApoTox-Glo三联体法测量存活率（A）和caspase-3样活性（B）。（C） Hoechst染色检测凋亡细胞，结果以凋亡细胞百分比表示。miR-34a的（D和E）实时RT-PCR（D）和Northern blot（E）分析。显示了一个具有代表性的斑点。为总RNA输入对斑点进行归一化。（F） SIRT1和乙酰基p53（Ac-p53）的免疫印迹。显示了具有代表性的免疫印迹。斑点分别归一化为内源性β-肌动蛋白或总p53。结果表示为至少4个独立实验的平均（±平均值标准误差）折叠变化。§,P（P）<0.05，和*，P（P）<0.01，来自16小时对照；†，P（P）<0.05，和，P（P）<0.01，来自各自的时间点控制。
图4
图4
DCA诱导原代大鼠肝细胞caspase依赖性细胞死亡。按照材料和方法中的描述分离细胞，并在存在或不存在50μM Z-VAD-fmk的情况下，用100μM DCA或不添加（对照）处理细胞16和28小时。细胞毒性（A）和类半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性（B）使用ApoTox-Glo三联体法测得。结果表示为3个独立实验的平均值（±平均值标准误差）折叠变化。§,P（P）<0.05，来自对照组；†P（P）<0.05，P（P）<0.05，仅来自DCA。
图5
图5
miR-34a抑制会损害DCA抑制SIRT1和诱导乙酰基p53的能力，以及凋亡特征。用miR-34a抑制剂（抗-miR-34a）或对照（抗-mi R对照）转染原代大鼠肝细胞，并用100μM DCA或不添加（对照）处理40 h，如材料和方法所述。（A） miR-34a抑制的实时RT-PCR分析。（B） 转染miR-34a抑制剂的细胞中SIRT1的免疫印迹（顶部）以及Wt和Mut-miR-34a-荧光素酶活性之间的比率（底部）。显示了具有代表性的免疫印迹。将斑点归一化为内源性β-肌动蛋白。用包含荧光素酶cDNA与SIRT1的3′UTR融合的报告载体共同转染细胞，该报告载体包含野生型（Wt）或突变型（Mut）miR-34a结合位点。巨细胞病毒-雷尼拉荧光素酶载体作为内标对照。（C） 乙酰基p53（Ac-p53）的免疫印迹。显示了具有代表性的免疫印迹。将印迹标准化为总p53。（D） Hoechst染色检测凋亡细胞，结果以凋亡细胞百分比表示（底部）。对照组（a）、DCA（b）、miR-34a抑制组（c）和经DCA治疗的miR-34a抑制组（d）的代表性图像如图所示（顶部）。棒材，10μm。（E） 通过ApoTox-Glo三联体分析测定细胞活力。（F） 线粒体通透性由3,3′-二己基氧羰基菁碘[DiOC]的保留损失决定6（3） 流式细胞术染色。（G） ROS水平测定为H的氧化2流式细胞术检测DCFDA染料。结果表示为4到6个不同实验的平均值（±平均值标准误差）折叠变化。§,P（P）<0.05，和*，P（P）<0.01，来自抗miR控制；†，P（P）<0.05，和，P（P）<0.01，来自DCA抗miR对照。
图6
图6
DCA加重了原代大鼠肝细胞中miR-34a依赖的信号传导和凋亡。用miR-34a前体（pre-miR-34a）或对照（pre-mi R对照）转染细胞，并用100μM DCA或不添加（对照）处理40 h，如材料和方法中所述。（A） miR-34a过度表达的实时RT-PCR分析。（B） 转染miR-34a前体的细胞中SIRT1的免疫印迹（顶部）以及Wt和Mut SIRT1 3′UTR荧光素酶活性的比率（底部）。显示了具有代表性的免疫印迹。将斑点归一化为内源性β-肌动蛋白。用报告载体共转染原代大鼠肝细胞，该报告载体由与SIRT1的3′UTR融合的萤光素酶cDNA组成，包含野生型（Wt）或突变型（Mut）miR-34a结合位点。巨细胞病毒肾萤光素酶载体作为内部标准对照。（C） 免疫细胞化学测定SIRT1定位。SIRT1染色（红色）和Hoechst染色（蓝色）显示为对照组（a）、DCA（b）、miR-34a过度表达（c）和经DCA处理的miR-34a过度表达（d）。棒材，10μm。放大倍数，×630。（D） 通过实时RT-PCR测定SIRT1 mRNA水平。（E） 乙酰基p53（Ac-p53）的免疫印迹。显示了具有代表性的免疫印迹。将斑点归一化为总p53。（F） 细胞活力（顶部）由ApoTox-Glo三重分析测定，细胞凋亡（底部）由Hoechst染色测定。（G） 通过ApoTox-Glo三联体分析测定Caspase-3样活性。结果表示为6个不同实验的平均值（±平均值标准误差）百分比。§,P（P）<0.05，和*，P（P）<0.01，来自miR前对照；†，P（P）<0.05，P（P）<0.01，来自miR-34a之前。
图7
图7
SIRT1的过度表达损害了原代大鼠肝细胞中miR-34a/SIRT1/p53通路的DCA诱导。按照材料和方法中的描述分离细胞，并用10μM或50μM白藜芦醇或不添加（对照）处理24小时。当指示时，细胞与100μM DCA共培养。（A） SIRT1和乙酰基p53（Ac-p53）的免疫印迹。显示了具有代表性的免疫印迹。斑点分别归一化为内源性β-肌动蛋白或总p53。（B） miR-34a的实时RT-PCR分析。结果表示为至少4个独立实验的平均（±平均值标准误差）折叠变化。白藜芦醇。§,P（P）<0.05，和*，P（P）<0.01，来自对照组；†，P（P）<0.05，和，P（P）<0.01，仅来自DCA。
图8
图8
DCA诱导原代大鼠肝细胞中miR-34a凋亡途径的p53依赖性激活。使用携带野生型p53人类序列的pCMV-Neo-Bam载体（pCMV-p53 Wt）或空载体（pCMCV-Neo-Bat）转染细胞，并用100μM DCA或不添加（对照）处理24 h，如材料和方法中所述。（A） miR-34a表达的实时RT-PCR分析。（B） SIRT1的免疫印迹。（C） p53的免疫印迹。显示了具有代表性的免疫印迹。蛋白质印迹归一化为内源性β-肌动蛋白。（D） 通过免疫组化p53/MDM2复合特异性免疫酶免疫分析测定的p53/MDM结合，并表示为相对于对照组的倍数变化。（E） 根据TransAM p53酶联免疫吸附试验和p53过度表达（顶部）和miR-34a抑制（底部）测定，核p53能够与其DNA共识识别序列结合的水平。（F） p53依赖性PUMA和miR-34a启动子激活。原代大鼠肝细胞与荧光素酶构建物共转染，PUMA启动子包含转录起始位点上游共有p53结合位点（Luc-PUMA）（上图）。或者，用pGL4报告载体共同转染细胞，该报告载体由融合到miR-34a启动子的荧光素酶cDNA组成，该启动子包含野生型（Wt）或突变型（Mut）p53结合序列（底部）。细胞还与巨细胞病毒-雷尼拉荧光素酶载体共转染，作为内标物。结果表示为5个不同实验的平均值（±平均值标准误差）折叠变化。§,P（P）<0.05，和*，P（P）<0.01，仅来自pCMV-Neo-Bam；†，P（P）<0.05，来自pCMV-Neo-Bam和DCA。
图9
图9
JNK1在原代大鼠肝细胞中负责DCA诱导的p53激活。用100μM DCA或不加DCA（对照）处理细胞16、28、40、52和64小时。或者，用设计用于敲除jnk1型（si-JNK1）或jnk2型（si-JNK2）基因表达和包含扰乱序列的对照siRNA，并按照材料和方法中的描述，使用100μM DCA或不添加（对照）处理24小时。（A至C）JNK磷酸化（pJNK）免疫印迹（A）、JNK1和JNK2（B）以及p53表达（C）。显示了具有代表性的免疫印迹。将斑点归一化为总JNK（pJNK）或β-肌动蛋白（JNK1、JNK2和p53）。（D） 通过免疫组化p53/MDM2复合特异性免疫酶免疫分析测定的p53/MDM结合，并表示为相对于对照组的倍数变化。（E） 根据TransAM p53酶联免疫吸附试验（顶部）和p53依赖的PUMA启动子激活（底部）确定的核p53能够与其DNA共识识别序列结合的水平。原代大鼠肝细胞与荧光素酶构建物共转染，PUMA启动子包含转录起始位点上游共有p53结合位点（Luc-PUMA）。对巨细胞病毒-雷尼拉荧光素酶活性的结果进行了标准化。（F） BAX和p21的免疫印迹。显示了具有代表性的免疫印迹。斑点归一化为β-肌动蛋白。结果表示为3到7个不同实验的平均值（±平均值标准误差）折叠变化。§,P（P）<0.05，和*，P（P）<0.01，来自control或si control；†，P（P）<0.05，和，P（P）<0.01，来自各自的时间点控制或来自具有DCA的si控制。
图10
图10
DCA通过JNK1调节细胞周期蛋白D1的表达。（A） 用miR-34a抑制剂（抗-miR-34a）或对照（抗-mi R对照）转染原代大鼠肝细胞，并用100μM DCA或不添加（对照）处理40 h，如材料和方法所述。用荧光素酶cDNA与含有p53结合位点的cyclin D1启动子融合的报告载体共同转染细胞。巨细胞病毒-雷尼拉荧光素酶载体作为内标对照。（B） 用特定的短干扰RNA（siRNA）核苷酸转染细胞，目的是敲除jnk1型（si-JNK1）或jnk2型（si-JNK2）基因表达和包含扰乱序列的对照siRNA，并按照材料和方法中的描述，使用100μM DCA或不添加（对照）处理24小时。细胞周期蛋白D1的免疫印迹（顶部）。显示了一个具有代表性的免疫印迹。将印迹标准化为内源性β-肌动蛋白。同时，将细胞与JNK-interacting protein 1（JIP-1）质粒的结合域[pCMV-Flag-JBD（JIP-1]和荧光素酶cDNA融合到cyclin D1启动子构建物上，并用100μM DCA或不添加（对照）处理24小时，如材料和方法（底部）所述。对巨细胞病毒-雷尼拉荧光素酶活性的结果进行了标准化。结果表示为至少3个不同实验的平均值（±平均值标准误差）折叠变化。§,P（P）<0.05，来自对照组；†，P（P）<0.05，仅来自DCA。
图11
图11
DCA诱导的原代大鼠肝细胞p53/miR-34a信号转导和凋亡依赖于JNK1。用特定的短干扰RNA（siRNA）核苷酸转染细胞，目的是敲除jnk1型或jnk2型如材料和方法中所述，基因表达和含有扰乱序列的对照siRNA，并用100μM DCA或不添加（对照）处理24小时。（A） 细胞与pGL4报告载体共转染，该报告载体由荧光素酶cDNA与含有野生型（Wt）或突变型（Mut）p53结合序列的miR-34a启动子融合而成。细胞还与巨细胞病毒-雷尼拉荧光素酶载体共转染，作为内标物。（B） miR-34a表达的实时RT-PCR分析。（C） 用包含荧光素酶cDNA与SIRT1的3′UTR融合的报告载体共同转染细胞，该报告载体包含野生型（Wt）或突变型（Mut）miR-34a结合位点。显示Wt与Mut miR-34a荧光素酶活性的比值。细胞还与巨细胞病毒-雷尼拉荧光素酶载体共转染，作为内标物。（D） 使用ApoTox-Glo三联体试验测定生存能力。结果表示为7个不同实验的平均值（±平均值标准误差）折叠变化。§，P（P）<0.05和*，P（P）<0.01，来自si Control；†，P（P）<0.05，来自带有DCA的si对照。
图12
图12
JNK和c-Jun通过DCA作为miR-34a/SIRT1/p53促凋亡途径的重要触发因子。用JNK-interacting protein 1（JIP-1）[pCMV-Flag-JBD（JIP-1]的结合域或显性阴性DN-c-Jun FlagΔ169质粒转染原代大鼠肝细胞，并用100μM DCA或不添加（对照）处理24 h，如材料和方法所述。（A） 用荧光素酶构建物与PUMA启动子共转染细胞，PUMA启动因子包含转录起始位点上游的一致p53结合位点（Luc-PUMA）。对巨细胞病毒-雷尼拉荧光素酶活性的结果进行了标准化。（B） miR-34a表达的实时RT-PCR分析。（C和D）Caspase-3样活性（C）和活性（D）使用ApoTox-Glo三联体分析测定。结果表示为5个不同实验的平均值（±平均值标准误差）折叠变化。§,P（P）<0.05，和*，P（P）<0.01，来自对照组；†，P（P）<0.05，和，P（P）<0.01，仅来自DCA。
图13
图13
c-Jun是DCA诱导大鼠原代肝细胞p53/miR-34a促凋亡信号传导过程中JNK1的关键靶点。细胞被转染了一种特殊的siRNA，目的是敲除c-jun公司基因表达（si-c-Jun）或阴性对照siRNA，并用100μM DCA或不添加（对照）处理24小时，如材料和方法所述。（A） c-Jun的免疫印迹。显示了具有代表性的免疫印记。斑点归一化为β-肌动蛋白。（B） miR-34a表达的实时RT-PCR分析。（C和D）SIRT1（C）和乙酰基p53（Ac-p53）（D）的免疫印迹。显示了具有代表性的免疫印迹。斑点分别归一化为内源性β-肌动蛋白或总p53。（E） 使用ApoTox-Glo三联体试验测定生存能力。结果表示为4个不同实验的平均值（±平均值标准误差）折叠变化。§,P（P）<0.05，来自si Control；†，P（P）<0.05，和，P（P）<0.01，来自带有DCA的si Control。
图14
图14
DCA激活JNK1/c-Jun/pp53/miR-34a/SIRT1促凋亡途径体内Wistar雄性大鼠在处死前经口灌胃给予250 mg/kg/天DCA 5天。同时，对照组大鼠按照材料和方法中的描述用水。（A） miR-34a的Northern blot（顶部）和实时RT-PCR分析。显示了一个具有代表性的斑点。为总RNA输入对斑点进行归一化。（B） SIRT1和乙酰基p53（Ac-p53）的免疫印迹。显示了具有代表性的免疫印迹。斑点分别归一化为内源性β-肌动蛋白或总p53。（C） JNK1、JNK2和C-Jun的免疫印迹。显示了具有代表性的免疫印记。将斑点归一化为内源性β-肌动蛋白。（D） 用ApoTox-Glo三重分析法测定Caspase-3样活性（左），用免疫组织化学法测定肝切片中Caspase-3活性定位（右）。在代表性对照组（a）和DCA治疗组（b）动物的肝脏切片中显示活性caspase-3染色（红色）和Hoechst染色（蓝色）。棒材，10μm。放大倍数，×630。（E） 肝切片中的荧光TUNEL测定。TUNEL阳性细胞（红色）和Hoechst染色（蓝色）显示在代表性对照（a）和DCA治疗（b）动物的肝脏切片中。棒材，10μm。结果表示为6只对照大鼠和6只DCA治疗大鼠的平均（±平均值标准误差）折叠变化。§,P（P）<0.05，和*，P（P）<0.01，来自对照组。
图15
图15
DCA不调节miR-195、-200a、-143、-145和-122的表达体内Wistar雄性大鼠在处死前经口灌胃给予250 mg/kg/天DCA 5天。同时，对照组大鼠按照材料和方法中的描述用水。显示了miR-195、miR-200a、miR-143、miR-145和miR-122的实时RT-PCR和Northern blot分析。结果表示为6只对照大鼠和6只DCA治疗大鼠的平均（±平均值标准误差）折叠变化。
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