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.2014年1月13日；33(2):129-45.
doi:10.1002/embj.201385946。

EGFR控制上皮形态发生过程中IQGAP基底外侧膜定位和有丝分裂纺锤体定向

Inmacada Bañón-Rodríguez公司 1, 曼努埃尔·加尔夫斯·桑蒂斯班（Manuel Gálvez-Santisteban）, Silvia Vergarajauregui公司, Minerva Bosch公司, Arantxa Borreguero-Pascual公司, 费尔南多·马丁·贝尔蒙特
附属公司

EGFR控制上皮形态发生过程中IQGAP基底外侧膜定位和有丝分裂纺锤体定向

Inmacada Bañón-Rodríguez公司等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

确定有丝分裂纺锤体的正确方向是上皮细胞分裂的关键步骤，以确保在器官发育和再生过程中正确形成上皮小管。虽然最近的发现已经确定了纺锤取向的一些分子机制，但对这一过程的许多方面仍知之甚少。在这里，我们使用3D-MDCK模型系统证明了由IQGAP1和上皮生长因子受体（EGFR）形成的一种新鉴定的蛋白质复合体在控制有丝分裂纺锤体取向方面的关键作用。IQGAP1是一种支架蛋白，调节从细胞间粘附到微管组织的许多细胞途径，其在基底外侧膜中的定位确保了正确的纺锤取向。通过IQ基序，IQGAP1与EGFR结合，EGFR负责维持IQGAP2在基底外侧膜域中的表达。沉默IQGAP1或干扰IQGAP2或EGFR的基底外侧定位，导致NuMA的非极化分布、有丝分裂纺锤体定向错误和单腔形成缺陷。

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数字

图1
图1
IQGAP1对于正确的主轴定向和单腔形成是必要的。

  1. 用靶向犬IQGAP1的三种不同的siRNA异二聚体转染MDCK细胞。转染细胞在3D培养中培养72小时，并在Western blots（WB）中分析siRNAs的效率。

  2. IQGAP1消耗的量化。siRNA#2在沉默IQGAP1方面最有效，导致90%的耗竭，因此它被用于所有后续实验中(n个 = 3; 值代表平均值±标准差）。

  3. 用对照或IQGAP1 siRNA转染MDCK细胞，并在3D培养中生长。72小时后，对囊肿进行Podxl（红色）、actin（绿色）和ToPro3（蓝色）染色。比例尺，5μm。

  4. 根据对照囊肿中观察到的单腔形成情况进行量化。只有59.5±5.75%的siRNA#2囊肿极化并形成单腔(n个 = 3; 值代表平均值±标准差）。

  5. 对照组和IQGAP1 siRNA囊肿的肌动蛋白（红色）和乙酰化微管蛋白（绿色）染色。比例尺，5μm。

  6. 测量有丝分裂纺锤体与根尖轴之间形成的角度，平均角度为：siControl=75.53±2.69°；siIQGAP1=45.47±4.57°(n个=3，每个实验>40个囊肿，数值代表平均值±s.e.m）。

  7. 实验设计方案（左面板）。核感染后立即在3D培养基中培养对照细胞和IQGAP1 KD细胞。4天后，与对照组（G3组）相比，对照组细胞组织在中央管腔周围的上皮类器官中（G1组），而IQGAP1-KD囊肿在单管腔形成中显示缺陷。对照细胞经胸腺嘧啶核苷（2 mM）处理后，与未经有丝分裂抑制剂处理的细胞形成具有单腔的较小囊肿的速率相同（G2组）。48小时后，IQGAP1干扰开始有效，尽管此时添加胸腺嘧啶完全恢复正常的管腔形成（G4组：右图）。在上述条件下生长4天的典型囊肿图像。比例尺，5μm。

  8. （G）中描述的每种条件下的单流明量化。单腔囊肿：G1组为73.66±1.23%；G2组为71.36±7.84%；G3组=52.16±5.13%；G4组=69.98±6.19%(n个=3个，每次实验>100个囊肿；值表示平均值±标准差）。误差条表示s.e.m.或s.d.：*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01.

可在线获取此图的源数据。
图2
图2
IQGAP1在间期和有丝分裂细胞中定位于基底外侧膜，其去极化导致纺锤体定位缺陷。

  1. 囊泡染色为微管蛋白（绿色）、肌动蛋白（红色）和IQGAP1（蓝色）。比例尺，5μm。

  2. 膀胱IQGAP1（绿色）、肌动蛋白（红色）和β-连环蛋白（蓝色）染色。比例尺，5μm。

  3. 囊肿生长72小时，用4μM PMA处理5、10或15分钟，并染色IQGAP1（绿色）、肌动蛋白（红色）和β-连环蛋白（蓝色）。显示内源性IQGAP1的基外侧（箭头）和顶端（箭头）定位。比例尺，5μm。

  4. 囊肿用IQGAP1（绿色）、肌动蛋白（红色）和ToPro3（蓝色）染色。黄线代表有丝分裂纺锤体的角度。比例尺，5μm。

  5. 测量有丝分裂纺锤体与根尖轴之间的夹角，平均夹角为：对照组为72.19±3.59°；PMA 5分钟=44.45±5.33°；PMA 10分钟=39.30±5.41°，PMA 15分钟=39.46±5.29°(n个=3，每次实验>30个细胞；值表示平均值±标准误差）。误差条代表s.e.m：*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01.

图3
图3
IQ基序是将IQGAP1定位于基底外侧膜所必需的。

  1. 显示所用IQGAP1结构的方案，每个结构都设计为GFP融合蛋白。

  2. 稳定表达每个结构的MDCK细胞在3D培养中生长形成囊肿，囊肿固定并染色肌动蛋白（红色）。指出了突变结构的基外侧（箭头）和顶端（箭头）定位。

  3. 与IQGAP1 siRNA一起转染的每个构建体的MDCK克隆在3D培养中生长，囊肿固定并染色Pdxl（红色）和actin（蓝色）。指出了突变结构的基外侧（箭头）和顶端（箭头）定位。

  4. 对每种结构在缺乏内源性IQGAP1的情况下形成单腔囊肿的能力进行量化，并用细胞总数的百分比表示(n个=3个，每次实验>50个囊肿；值表示平均值±标准差）。

  5. 对每个克隆体形成单腔囊肿的能力进行量化，并用细胞总数的百分比表示(n个=3个，每次实验>50个囊肿；值代表平均值±标准差。）。

  6. 测量有丝分裂纺锤体与根尖轴之间形成的角度，平均角度为：IQGAP1-GFP=71.56±2.91°；IQGAP1:N=48.45±3.67°；IQGAP1:C=48.01±3.41°(n个=3，每次实验>35个细胞；值表示平均值±标准误差）。

数据信息：错误栏代表s.e.m.或s.d.：*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01. 比例尺，5μm。
图4
图4
IQ基序将IQGAP1限制在基底外侧膜。

  1. 显示所用结构的方案，每个结构设计为GFP融合蛋白。

  2. 将稳定表达IQGAP1-ΔIQm-eGFP的MDCK细胞转染对照细胞或IQGAP-siRNA，并在3D培养基中生长形成囊肿，囊肿固定并共同染色肌动蛋白（红色）和β-连环蛋白（蓝色）。突变体结构的基外侧（箭头）和顶端（箭头）定位被指出。

  3. IQGAP1-ΔIQm稳定克隆形成单腔囊肿的能力被量化，并表示为囊肿总数的百分比：对照组，98±1.4%；IQGAP1-ΔIQm，61.5±7.4%；siIQGAP1，59.5±7.05%；IQGAP1-ΔIQm+siIQGAP2，46.2±4.18%(n个=3个，每次实验>50个囊肿；值代表平均值±标准差。）。

  4. MDCK IQGAP1-ΔIQm-eGFP囊肿被乙酰化微管蛋白染色（红色），黄色线代表有丝分裂纺锤角。

  5. 测量有丝分裂纺锤体与根尖轴之间形成的角度，平均角度为：对照=76.10±2.29°，IQGAP1-ΔIQm=43.09±4.40°(n个=3，每次实验40个细胞；值表示平均值±s.e.m）。

  6. MDCK IQGAP1-ΔIQm-eGFP囊肿用PMA处理15分钟，固定并共同染色肌动蛋白（红色）和β-连环蛋白（蓝色）。突变体结构的基外侧（箭头）和顶端（箭头）定位被指出。

数据信息：错误栏代表s.d.或s.e.m.：*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01. 比例尺，5μm。
图5
图5
EGFR介导IQGAP1定位于基底外侧膜并控制纺锤体取向。

  1. 对照囊肿和那些转染了IQGAP1 siRNA的囊肿进行EGFR（绿色）、肌动蛋白（红色）和β-连环蛋白（蓝色）染色。箭头表示在缺乏IQGAP1的情况下EGFR的基底外侧定位。

  2. 对照囊肿染色为微管蛋白（绿色）、肌动蛋白（红色）和EGFR（蓝色）。

  3. 对照组和IQGAP1 siRNA转染的囊肿生长72小时，暴露于4μM PMA中，然后染色EGFR（绿色）、肌动蛋白（红色）和β-连环蛋白（蓝色）。

  4. 对照囊肿生长72 h，用EGF（2 ng/ml）处理，然后染色EGFR（绿色）、肌动蛋白（红色）和β-连环蛋白（蓝色）。

  5. 对照囊肿生长72小时，用EGF（2 ng/ml）处理，然后染色IQGAP1（绿色）、肌动蛋白（红色）和β-连环蛋白（蓝色）。内源性IQGAP1的基外侧（箭头）和顶端（箭头）定位被指出。

  6. EGF处理后，IQGAP1均匀分布在心尖膜和基底外侧膜之间（心尖膜处为45.66±2.21%IQGAP2）。使用ImageJ软件量化荧光强度，并以百分比表示(n个=3个，每次实验>50个囊肿；值表示平均值±标准差）。

  7. 对照组和EGF处理的囊肿染色为微管蛋白（绿色）、肌动蛋白（红色）和IQGAP1（蓝色）。黄线代表有丝分裂纺锤体角度。

  8. 有丝分裂纺锤体与根尖轴之间形成的平均角度为：对照=74.33±2.70°，EGF处理=43.04±4.14°(n个=3，每次实验>40个细胞；值表示平均值±标准误差）。

数据信息：错误栏代表s.d.或s.e.m.：*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01. 比例尺，5μm。
图6
图6
EGFR介导IQGAP1定位于基底外侧膜，并控制纺锤体取向。

  1. 显示所用结构的方案，每个结构设计为GFP融合蛋白。将稳定表达C2A/B intraEGFR的MDCK细胞培养72小时，形成囊肿，然后对肌动蛋白（红色）和IQGAP1（蓝色）进行染色。内源性IQGAP1的顶端定位如箭头所示。

  2. 量化C2A/B intraEGFR稳定克隆形成单腔囊肿的能力，并以囊肿总数的百分比表示：对照组为88.5±0.7%；C2A/B EGFR内注射，45.96±1.23%(n个=3个，每次实验>50个囊肿；值代表平均值±标准差。）。

  3. C2A/B表皮生长因子受体内囊肿染色为微管蛋白（红色），黄色线代表有丝分裂纺锤角。

  4. 有丝分裂纺锤体与根尖轴之间形成的平均角度为：对照组=75.14±2.24°，EGFR=44.90±4.61°(n个=3，每次实验40个细胞；值表示平均值±标准误差）。

数据信息：错误栏代表s.d.或s.e.m.：*P（P） < 0.05; **P（P）<0.01。比例尺，5μm。
图7
图7
LLC-PK1细胞EGFR和IQGAP1呈非极化分布，因此出现纺锤体定向错误。A、 B LLC-PK1囊肿生长72 h，固定，然后染色（A）EGFR（绿色）、肌动蛋白（红色）和β-连环蛋白（蓝色），或（B）IQGAP1（绿色），肌动素（红色）以及β-连环素（蓝色）。显示内源性EGFR或IQGAP1的顶端定位（箭头）。C形成单个腔的囊肿百分比：MCDK，82.96±3.17%；LLC-PK1，51.86±5.94%(n个=3个，每次实验>100个囊肿；值代表平均值±标准差。）。对D LLC-PK1囊肿进行乙酰化微管蛋白（绿色）、肌动蛋白（红色）和β-连环蛋白（蓝色）染色。黄线代表有丝分裂纺锤体的角度。E平均主轴角：MDCK=74.73±3.52°，LLC-PK1=45.37±5.07°(n个=3，每次实验30个囊肿；值表示平均值±标准误差）。F、 G LLC-PK1 AP1B囊肿生长72 h，固定，然后染色（F）EGFR（绿色）、肌动蛋白（红色）和β-连环蛋白（蓝色），或（G）IQGAP1（绿色），肌动蛋白。内源性EGFR或IQGAP1的基底外侧定位如箭头所示。H对LLC-PK1-AP1B囊肿形成单个腔的百分比进行量化：LLC-PK1-AP1B，65.57±5.23%(n个=3个，每次实验>80个囊肿；值代表平均值±标准差。）。对I LLC-PK1-AP1B囊肿进行乙酰化微管蛋白（绿色）、肌动蛋白（红色）和β-连环蛋白（蓝色）染色。黄线代表有丝分裂纺锤体角度。J平均主轴角：LLC-PK1=45.29±5.09°，LLC-PK1 AP1B=61.80±5.30°(n个=3，每次实验30个囊肿；值表示平均值±标准误差）。数据信息：错误栏表示s.d.或s.e.m：*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01. 比例尺，5μm。
图8
图8
在没有IQGAP1的情况下，NuMA而不是LGN的分布会发生改变。

  1. 用对照或IQGAP1 siRNA转染表达LGN-GFP的稳定Tet-Off T23细胞。从稳定表达细胞的培养基中去除多西环素，然后立即将其电镀并在3D培养基中生长48小时。然后固定细胞并染色微管蛋白（红色）和IQGAP1（蓝色）。结构的基底外侧定位如箭头所示。比例尺，5μm。

  2. 用对照或IQGAP1 siRNA转染MDCK细胞，并在3D培养中生长。固定囊肿并对NuMA（绿色）、微管蛋白（红色）和IQGAP1（蓝色）进行染色。显示NuMA的基外侧（箭头）和顶端（箭头）定位。比例尺，5μm。

  3. 在3D培养基中培养表达Ct-LGN-myc的稳定Tet-Off T23细胞72小时（左侧）或48小时，然后再将多西环素从培养基中去除24小时（右侧）。然后固定细胞，并对其进行IQGAP1（红色）和ZO1（蓝色）染色。比例尺，5μm。

图9
图9
顶部面板EGFR与IQGAP1的IQ基序结合，并限制其定位于基底外侧膜。中间面板在没有IQGAP1的情况下，EGFR仅限于基底外侧膜。然而，NuMA和星形微管的+端任意附着在膜上，导致有丝分裂纺锤体定向错误。底部面板EGF治疗激活EGFR，导致受体通过小泡内化。IQGAP1对基底外侧膜的限制随后消失，有丝分裂纺锤体呈随机取向，有利于小管生成。
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