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.2014年1月10日11时3分。
doi:10.1186/1742-4690-11-3。

新型限制因子RNA-相关早期抗病毒因子(REAF)抑制人类和猴免疫缺陷病毒

附属公司

新型限制因子RNA-相关早期抗病毒因子(REAF)抑制人类和猴免疫缺陷病毒

凯利·马诺等。 逆转录病毒学. .

摘要

背景:新的抗病毒限制因子的发现揭示了先天感觉和免疫的未知方面。我们通过全基因组siRNA筛选,确定了RNA相关的早期抗病毒因子(REAF),以筛选作用于病毒复制早期阶段的人类免疫缺陷病毒(HIV)限制因子。

结果:在特异性siRNA敲除REAF后,我们使用焦点形成单元(FFU)检测观察到HIV-1感染挽救了50倍以上。定量PCR显示,REAF敲除导致早期和晚期逆转录物增加,从而影响整合水平。因此,REAF似乎在逆转录期间病毒生命周期的早期阶段起作用。相反,当REAF在靶细胞中过度表达时,检测到的感染细胞更少,产生的逆转录物更少。人类REAF还可以抑制HIV-2和猴免疫缺陷病毒(SIV)感染。REAF与病毒核酸结合,可能起到阻止逆转录的作用。

结论:该报告明确指出,REAF与APOBEC和SAMHD1一起,在复制周期的早期,即细胞进入后,是一种有效的HIV复制抑制剂。我们建议REAF是一个抗病毒监测系统的一部分,它可以摧毁进入的逆转录病毒。这种新的机制适用于任何细胞内病原体对细胞的入侵。

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数字

图1
图1
REAF抑制HIV和SIV感染,发生在复制的早期进入后阶段。(A)与CB对照组相比,REAF siRNA敲除后HeLa-CD4细胞裂解物的Western blot。REAF显示为80、130(微弱)和220kDa的三个波段,但并非所有实验都能检测到所有波段。添加管蛋白(57 kDa)作为加载控制。(B)REAF siRNA敲低72小时后,HeLa-CD4细胞被HIV-1攻击89.6,HIV-2CBL-23型、SIV年度股东大会(非洲绿猴;TYO-1),SIV雨衣(猕猴;32H)和SIV性虐待(煤烟芒果;B670)。感染后48小时p24免疫染色(pi)表明REAF可以拯救病毒复制。结果显示为与非靶向对照siRNA(CB)相比的折叠变化。(C)siRNA敲除REAF导致增强HIV-1 RT产物-早期和晚期(0-8小时pi)和(D)前病毒DNA(-阻塞,2-48小时pi)。HIV-1 DNA拷贝被归一化为基因组GAPDH,并呈现在每百万个细胞中。结果是平均值±重复进行的代表性实验的s.d。
图2
图2
REAF的过度表达带来了限制,这是依赖于进入的病毒途径。(A)REAF的过度表达限制了早期HIV-1 DNA的产生。用pEGFP-C3或REAF-EGFP瞬时转染HEK 293 T细胞,并用α-GFP抗体进行Western blot检测。转染REAF-EGFP导致REAF的表达(110、160和250 kDa,包括EGFP标签(30 kDa))。使用靶向3'UTR的siRNA从HeLa-CD4细胞中敲除内源性REAF。(B)在短暂过表达REAF-EGFP或pEGFP-C3并用HIV-1攻击后,对感染细胞进行检测89.6结果显示为FFU/ml,为平均值±重复进行的代表性实验的s.d。(C)HeLa-CD4细胞中REAF-EGFP的瞬时过表达导致HIV-1攻击后8小时RU5和晚期RT产物减少89.6HIV-1 DNA拷贝被归一化为基因组GAPDH,并呈现在每百万个细胞中。结果是平均值±重复进行的代表性实验的s.d。(D)REAF的限制取决于病毒进入途径。艾滋病病毒1型89.6Δ环境用VSV-G包膜进行假分型,用于在REAF siRNA敲除后挑战HeLa-CD4细胞。p24免疫染色检测FFU,并与HIV-1进行比较89.6结果显示为FFU/ml,为平均值±重复进行的代表性实验的s.d。
图3
图3
REAF与病毒核酸相互作用。(A)HeLa-CD4细胞裂解液的寡核苷酸d(T)免疫沉淀表明,REAF与捕获的RNA结合。细胞裂解液在与寡核苷酸(dT)珠孵育之前用DNase或滴定的RNaseA/H处理。免疫沉淀蛋白通过Western blotting进行分析,并检测REAF以及阳性(PABP)和阴性(GAPDH)对照。(B)用pEGFP-C3或REAF-EGFP瞬时转染HEK 293 T细胞,并用α-REAF抗体进行Western blot检测。在输入样品(泳道1和2)中以及用pEGFP-C3(内源性REAF;泳道7和8)或用α-REAF抗体转染的REAF-EGFP(内源性和外源性REAF;泳道9和10)的样品的IP后,可以检测到内源性和外源性REAF,但在单独用IgG进行IP后不能检测到(泳道3-6)。(C)RU5或晚期HIV-1 DNA qPCR产物的数量被量化并归一化为输入和IgG阴性对照。内源性REAF与病毒核酸相关,在过度表达REAF-EGFP的细胞中富集。
图4
图4
REAF在HIV-1感染时下调,限制需要逆转录。(A)HIV-1攻击后REAF mRNA的时间进程89.6.cDNA分析的qPCR结果归一化为β-肌动蛋白mRNA水平。(B)HIV-1感染后,REAF蛋白水平下调89.6用MG132(10μM)处理可防止REAF蛋白降解。Tubulin作为一种负荷控制。仅显示了REAF的低频段(80 kDa)–并非所有实验都检测到所有频带。(C)AZT(100 nM)治疗后,挑战HIV-189.6在1小时π时不再引起REAF的耗尽。GAPDH包含在装载控制中。

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引用人

工具书类

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