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.2014年3月；10(3):416-30.
doi:10.4161自动.27286。 Epub 2013年12月23日。

乙型肝炎病毒X蛋白通过破坏溶酶体成熟抑制自噬降解

刘波（Bo Liu） 1, 蒙地芳 1, 叶虎 1, 黄宝山 1, 李宁 1, Chunmei Chang（张春梅） 1, Rui Huang（鲁伊·黄） 1, 小旭 2, 杨正刚 三, Zhi Chen先生 三, 刘伟（音译） 4
附属公司

乙型肝炎病毒X蛋白通过破坏溶酶体成熟抑制自噬降解

刘波（Bo Liu）等。 自噬. 2014年3月.

摘要

自噬是一种溶酶体依赖的细胞降解途径，自噬缺陷与多种疾病特别是癌症有关。最近，在肝细胞中发现了与乙型肝炎病毒（HBV）相关的肝细胞癌（HCC）有关的乙型肝炎病毒X（HBx）蛋白对自噬的激活。然而，HBx激活的自噬与HBV致癌的潜在机制和相关性尚不清楚。这里，通过在肝细胞和肝癌细胞中转染HBV基因组DNA和HBx，我们发现HBV或HBx诱导的自噬体形成伴随着不变的MTOR（雷帕霉素的机械靶点）活性，并减少LC3和SQSTM1/p62（典型自噬货物蛋白）的降解。进一步的功能和形态分析表明，HBx显著削弱了溶酶体酸化，导致溶酶体降解能力下降，未成熟溶酶体的积累可能是通过与V-ATP酶的相互作用影响其溶酶体靶向。此外，临床标本检测显示，慢性HBV感染和HBV相关肝癌患者肝组织中的SQSTM1和未成熟溶酶体水解酶CTSD（组织蛋白酶D）增加。这些数据表明，HBx对溶酶体功能的抑制作用是抑制自噬降解的原因，这可能对HBV相关HCC的发展至关重要。

关键词：自噬；乙型肝炎病毒；乙型肝炎病毒X蛋白；肝细胞癌；溶酶体。

PubMed免责声明

数字

无
图1。HBx诱导自噬体的积累。(A类)将HBV基因组DNA（HBV）或HBx阴性的HBV基因组DNA（HBVX）转染Huh7细胞−). 转染后48小时，细胞被HBcAg和LC3抗体染色，并通过共焦显微镜成像。比例尺：20µm。(B类)HBV或HBVX阳性或阴性细胞中每细胞LC3点数量的统计分析−存在或不存在氯喹（CQ）或巴非霉素A1（Baf A1）。数据表示为平均值±SEM，n=50。(C类)用GFP或HBx-GFP转染L02和Huh7细胞。转染后48小时，用LC3抗体对细胞进行免疫染色并成像。只显示了L02细胞的图像。比例尺：20µm。(天)对表达GFP或HBx-GFP的细胞中每个细胞的LC3点数量进行统计分析。只对GFP-或HBx-GFP-阳性细胞进行计数。数据表示为平均值±SEM，n=50。(E类)将L02和Huh7细胞饥饿或转染GFP或HBx-GFP 48 h，然后用western blot检测细胞LC3水平。(F类)电子显微镜观察到表达GFP（对照）或HBx-GFP的细胞中有自噬空泡。箭头表示自噬液泡。比例尺：0.5µm。该图显示了细胞中自噬空泡的细胞质占据率的统计分析。数据以平均值±SEM表示，n=20。(G公司)从对照组和HBV相关HCC患者的肝组织中分离出自噬空泡。然后用western blot分析HBx、LC3和LAMP1水平。Hom，肝匀浆；AV，自噬空泡***P（P）< 0.001.
无
图2。HBx触发的自噬体积聚的特征。(A类)Huh7细胞用雷帕霉素处理或用GFP或HBx-GFP转染48小时。使用特异性抗磷酸化MTOR或抗磷酸化-RPS6KB抗体通过蛋白质印迹分析MTOR和RPS6KB的磷酸化。(B类)对有或无HBx-GFP表达的Huh7细胞进行48小时的饥饿或雷帕霉素治疗。然后固定细胞并用LC3抗体染色。每个细胞的LC3-dots数量被量化，并表示为平均值±SEM，n=50**P（P）<0.01。表达GFP的细胞被用作HBx-GFP表达细胞的对照。(C类)细胞中LC3的Western blot分析(B类).
无
图3。HBx抑制自噬降解。(A类)假彩色编码图像显示Huh7细胞中LC3强度GFP、HBx-GFP、乙肝病毒或HBVX的表达−. (B类)GFP、HBx-GFP、乙肝病毒或HBVX细胞表达中每细胞相对平均LC3强度的量化−，n=30。(C类)稳定表达GFP-LC3的L02细胞要么被饥饿，要么被100nM巴非霉素A处理1（Baf A1）转染12 h或HBx-HA转染48 h，然后用抗GFP抗体进行western blot分析。注意GFP片段的产生。(天)转染HBV或HBVX的Huh7细胞−转染后48小时用HBcAg和SQSTM1抗体固定和染色。右侧所示的定量表示表达HBV或HBVX的细胞中SQSTM1的相对荧光强度−在存在或不存在50µM氯喹（CQ）的情况下，n=30。(E类)用100 nM Baf A1处理GFP或HBx-GFP表达的Huh7细胞12 h。用western blot分析细胞SQSTM1水平。右侧所示的定量表示按ACTB标准化的细胞的相对SQSTM1水平，并且从3个独立实验中量化了与表达GFP的对照细胞相比的折叠变化。所有定量数据均表示为平均值±SEM***P（P）< 0.001. 比例尺：20µm。
无
图4。HBx不影响自噬体-溶酶体融合。(A类)表达RAB7A-GFP的L02细胞要么被饥饿，要么被HBx-Cherry或Cherry共转染。然后将细胞固定，用抗LC3抗体染色，并通过共聚焦显微镜成像。(B类)RAB7A-GFP和LC3共定位系数的统计分析。共定位系数表示为RAB7A-GFP阳性的LC3点状信号的百分比。(C类)含或不含RAB7A的饥饿L02细胞内源性LC3和LAMP1的克隆化T22N型-GFP表达，或在HBx-GFP表达的L02细胞中。RAB7A型T22N型-GFP表达细胞作为阴性对照。(天)LC3和LAMP1共定位系数的统计分析。共定位系数表示为LAMP1阳性的LC3点状信号的百分比。(E类)将表达Cherry-LC3的Huh7细胞饥饿或与HBV基因组DNA共转染48 h。然后固定细胞，用HBcAg和LAMP1抗体染色，并成像。(F类)樱桃-LC3和LAMP1共定位系数的统计分析。共定位系数表示为对LAMP1阳性的Cherry-LC3点状信号的百分比。使用Velocity软件进行量化，数值代表30个细胞的平均±SEM**P（P）<0.01。比例尺：5µm。
无
图5。HBx损害溶酶体降解能力。(A类)表达GFP或HBx-GFP的Huh7细胞与100 ng/ml EGF孵育15分钟，然后洗去EGF。在EGF刺激后的指定时间点，细胞被固定并用EGFR抗体进行免疫染色。注意EGFR punta的积累和随后的降解。(B类)GFP或HBx-GFP细胞表达中每个细胞的平均EGFR强度的量化。EGF处理1小时后，将数值与细胞内的强度进行标准化。数据表示为平均值±SEM，n=30**P（P）<0.01。(C类)在含有或不含100 nM巴非霉素A的GFP或HBx-GFP表达细胞中孵育EGF后指定时间点的EGFR的Western blot分析1（Baf A1）处理12小时(天)将Huh7细胞与Cherry-LC3和GFP或Cherry-TC3和HBx-GFP共转染。转染后48小时，表达GFP的细胞因饥饿而积累自噬体。然后将10 mM 3-甲基腺嘌呤（3-MA）添加到GFP-或HBx-GFP-表达细胞中，以阻止新自噬体的形成，并在指定的时间点观察到形成的樱桃-LC3阳性自噬小体的降解。(E类)表达GFP或HBx-GFP的Huh7细胞按(天). western blot检测细胞中LC3水平。比例尺：20µm。
无
图6。HBx抑制溶酶体酸化。(A类)用5µM吖啶橙（AO）标记表达CFP或HBx-CFP的Huh7活细胞。AO通过515/530-nm带通滤波器（绿色）或580-nm长通滤波器（红色）成像。注意HBx-CFP表达细胞中细胞质AO-red点的减少。用100 nM巴非霉素A处理的细胞1（Baf A1）持续24小时作为阳性对照，显示AO-red点从细胞质中完全消失。(B类)对表达CFP或HBx-CFP或用Baf A1处理的细胞中每个细胞的AO-red点数进行统计分析，n=30。(C和E类)表达樱桃-GFP-LC3的活Huh7细胞(C类)或Cherry-GFP-SQSTM1(E类)饥饿或与HBx-CFP共转染48小时，然后通过共焦显微镜对细胞成像。(D和F)对绿色荧光蛋白阳性的点状樱桃信号百分比的统计分析(C和E)，n=30。所有定量数据均表示为平均值±SEM**P（P）<0.01。比例尺：10µm。
无
图7。HBx抑制溶酶体的成熟。(A和B)通过免疫染色分析48小时表达GFP或HBx-GFP的Huh7细胞(A类)或western blot(B类)使用特定的EEA1抗体。(C类)表达GFP或HBx-GFP的Huh7细胞48小时后用LAMP1抗体染色，并通过共焦显微镜成像。右侧显示的定量表示GFP或HBx-GFP表达细胞中每个细胞的LAMP1点数，n=30。(天)Western blot分析48小时表达GFP或HBx-GFP的Huh7细胞中的LAMP1和LAMP2水平，右侧显示的定量表示与ACTB标准化的相对LAMP1/2蛋白水平，数据来自3个独立实验。(E类)GFP-或HBx-GFP-转染Huh7细胞中CTSD的Western blot分析。请注意，Inter-CTSD增加，而到期-CTSD减少。右侧所示的定量表示相对CTSD蛋白水平归一化为ACTB，数据来自3个独立实验。前CTSD，前体组织蛋白酶D；中间组织蛋白酶D；成熟-CTSD，组织蛋白酶D的成熟形式；*，非特异性条带。(F类)表达Cherry或HBx-Cherry的Huh7细胞用1 mM Body-FL-pepstatin A负载48 h。用PBS洗涤3次后，用共焦显微镜观察细胞。右侧所示的定量表示表达Cherry或HBx-Cherry的细胞中每个细胞的Body-FL-pepstatin A点数，n=30。(G公司)用HA标记的V-ATPase V1D和GFP或HA标记的V-ATPase V1D和HBx-GFP转染Huh7细胞48h，然后固定细胞，用HA和LAMP1抗体染色并成像。(H（H）)用抗GFP抗体免疫沉淀表达GFP或HBx-GFP的Huh7细胞，用抗V-ATPase V1D抗体免疫印迹分析免疫复合物。所有定量数据均表示为平均值±SEM***P（P）< 0.001. 比例尺：10µm。
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图8。在人体组织中评估溶酶体功能。(A和B类)代表性免疫染色(A类)和western blot(B类)对照组正常肝组织、肝癌和HBV相关HCC患者非肿瘤组织中LC3的分析。注意肿瘤和非肿瘤样本中LC3-bunta和LC3的积累。(C和天)免疫染色(C类)和蛋白质印迹(天)人体组织中SQSTM1的分析。(E类)人体组织中LAMP1的免疫染色。(F类)组织中LAMP1和CTSD的Western blot分析。注意成熟形式的减少和中间形式的积累。比例尺：10µm。
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