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.2014年4月;28(4):1666-81.
doi:10.1096/fj.13-240390。 Epub 2013年12月30日。

神经元特异性表达CuZnSOD可防止纯合子CuZnSOD敲除小鼠肌肉质量和功能的丧失

附属公司

CuZnSOD的神经元特异性表达可防止纯合子CuZnSOD基因敲除小鼠肌肉质量和功能的丧失

Giorgos K Sakellariou公司等。 美国财务会计准则委员会J. 2014年4月.

摘要

Sod1(-/-)小鼠中铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)的缺失会导致衰老过程中肌肉质量和力量的加速损失,但这种损失不会因肌肉特异性缺失CuZnSOD而发生。为了确定运动神经元在肌肉衰退中的作用,我们制作了转基因Sod1(-/-)小鼠,其中CuZnSOD在突触素1启动子(SynTgSod1)小鼠的控制下表达。SynTgSod1(-/-)小鼠在大脑、脊髓和外周神经中表达CuZnSOD,但在其他组织中不表达。SynTgSod1(-/-)小鼠的坐骨神经CuZnSOD含量约为对照小鼠的20%,但与对照动物相比,SynTg Sod1小鼠的肌肉质量或等长力量没有减少,而年龄匹配的Sod1鼠的肌肉质量和力量减少了30-40%。此外,在Sod1(-/-)小鼠肌肉中观察到的氧化损伤增加和应激反应适应在SynTgSod1小鼠中没有出现,而神经肌肉连接(NMJ)结构和功能的退化在Sod2(-/--)小鼠中发生,但在SynT gSod2小鼠中没有发生。我们的数据表明,神经元中特定的CuZnSOD表达足以保护Sod1(-/-)小鼠的NMJ和骨骼肌结构和功能,并表明运动神经元中的氧化还原稳态在衰老过程中启动肌肉减少症中起着关键作用。

关键词:SOD1;热休克蛋白;神经肌肉接头;氧化应激。

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数字

图1。
图1。
Sod1神经元拯救的产生草皮1−/−小鼠(同步TgSod1−/−).A类)生成Syn的示意图-hSOD1型转基因小鼠及其育种草皮1−/−小鼠生成同步TgSod1−/−老鼠。B类,C类)AT中SOD1含量的Western blot分析(B类)和GTN(C类)的肌肉草皮1−/−、重量和同步TgSod1−/−老鼠。D类,E类)SOD1的Western blot分析(D类)和SOD2(E类)坐骨神经含量草皮1−/−、重量和同步TgSod1−/−小鼠和斑点密度定量*P(P)< 0.05重量百分比。F类)Western blot分析WT脊髓(SC)SOD1含量,草皮1−/−,以及同步TgSod1−/−小鼠和印迹的密度定量*P(P)< 0.05.重量。G公司)肝脏SOD1含量的代表性Western blot草皮1−/−、WT和同步TgSod1−/−老鼠。H–J型)骨骼肌中SOD1和SOD2酶活性的天然凝胶染色(H(H)),大脑()和脊髓(J)来自WT,草皮1−/−,以及同步TgSod1−/−老鼠。K(K))来自WT的腰椎脊髓背角的横截面,草皮1−/−,以及同步TgSod1−/−用人类SOD1(绿色)和GFAP(红色)标记小鼠,GFAP是星形胶质细胞的标记物。细胞核(蓝色)标记DAPI(×100)。
图1。
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Sod1神经元拯救的产生草皮1−/−小鼠(同步TgSod1−/−).A类)生成Syn的示意图-hSOD1型转基因小鼠及其育种草皮1−/−小鼠生成同步TgSod1−/−老鼠。B类,C类)AT中SOD1含量的Western blot分析(B类)和GTN(C类)的肌肉草皮1−/−、重量和同步TgSod1−/−老鼠。D类,E类)SOD1的Western blot分析(D类)和SOD2(E类)坐骨神经含量草皮1−/−、重量和同步TgSod1−/−小鼠和斑点密度定量*P(P)< 0.05.重量。F类)WT的脊髓(SC)的SOD1含量的蛋白质印迹分析,草皮1−/−,以及同步TgSod1−/−小鼠和斑点密度定量*P(P)< 0.05重量百分比。G公司)肝脏SOD1含量的代表性Western blot草皮1−/−、重量和合成代谢产物1−/−老鼠。H–J型)骨骼肌中SOD1和SOD2酶活性的天然凝胶染色(H(H)),大脑()和脊髓(J)来自WT,草皮1−/−,以及同步TgSod1−/−老鼠。K(K))来自WT的腰椎脊髓背角横切面,草皮1−/−,以及同步TgSod1−/−用人类SOD1(绿色)和GFAP(红色)标记小鼠,GFAP是星形胶质细胞的标记物。细胞核(蓝色)标记DAPI(×100)。
图2。
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肌肉形态同步TgSod1−/−老鼠。A类)WT的GTN肌肉横切面,草皮1−/−,以及同步TgSod1−/−用WGA染色小鼠,以显示细胞外基质和DAPI,以标记细胞核,并显示纤维大小和中央定位细胞核的存在。B类)显示中央定位细胞核的纤维百分比*P(P)与WT小鼠的值相比,<0.05。C类)WT的GTN肌肉平均纤维CSA,草皮1−/−,以及同步TgSod1−/−小鼠(n个=4).D类)WT中GTN肌纤维CSA的频率分布,草皮1−/−,以及同步TgSod1−/−小鼠(n个=4).E、 F类)典型的西方慢斑(E类)而且速度很快(F类)WT和GTN肌肉的MyHC含量同步TgSod1−/−老鼠。G公司)WT和同步TgSod1−/−老鼠。
图2。
图2。
肌肉形态同步TgSod1−/−老鼠。A类)来自WT的GTN肌肉的横截面,草皮1−/−,以及同步TgSod1−/−用WGA染色小鼠,以显示细胞外基质和DAPI,以标记细胞核,并显示纤维大小和中央定位细胞核的存在。B类)显示中央定位细胞核的纤维百分比*P(P)与WT小鼠的值相比,<0.05。C类)WT的GTN肌肉平均纤维CSA,草皮1−/−,以及同步TgSod1−/−小鼠(n个=4).D类)WT中GTN肌纤维CSA的频率分布,草皮1−/−,以及同步TgSod1−/−小鼠(n个=4).E、 F类)典型的西方慢斑(E类)而且速度很快(F类)WT和GTN肌肉的MyHC含量同步TgSod1−/−老鼠。G公司)WT和GTN肌肉的电子显微照片同步TgSod1−/−老鼠。
图3。
图3。
肌肉功能同步TgSod1−/−老鼠。A类)根据WT的GTN肌肉总纤维CSA标准化的最大等长比力,草皮1−/−,以及同步TgSod1−/−15个月大的小鼠(n个=5).B类)WT GTN肌肉直接肌肉和神经刺激期间产生的力的比较,草皮1−/−,以及合成代谢产物1−/−小鼠(n个=5). 数据表示直接肌肉刺激产生的力的增加,表示为神经刺激产生力的百分比*P(P)< 0.05与。重量。
图4。
图4。
骨骼肌和大脑的氧化损伤标志物同步TgSod1−/−老鼠。A类)通过WT骨骼肌和大脑中F2-异前列腺素含量评估脂质过氧化,草皮1−/−,以及合成代谢产物1−/−老鼠。B类)小鼠骨骼肌3-NT含量变化的Western blot分析草皮1−/−、重量和同步TgSod1−/−小鼠和斑点密度定量。C类)猪骨骼肌中过氧亚硝酸盐还原酶PRXV含量的典型Western blots草皮1−/−、重量和同步TgSod1−/−小鼠和斑点密度定量*P(P)< 0.05.重量。
图5。
图5。
骨骼肌RONS调节蛋白含量同步TgSod1−/−老鼠。nNOS的代表性Western blots(A类)、eNOS(B类)、iNOS(C类)和SOD2(D类)骨骼肌蛋白质含量草皮1−/−、重量和同步TgSod1−/−小鼠和斑点密度定量*P(P)< 0.05.重量。
图6。
图6。
骨骼肌中的热休克蛋白合成代谢产物1−/−老鼠。HSP10的典型蛋白印迹(A类),热休克蛋白25(B类),热休克蛋白60(C类),HSP72(D类)和HSC70(E类)骨骼肌蛋白质含量草皮1−/−、重量和同步TgSod1−/−小鼠和斑点密度定量。HSP72在WT和同步TgSod1−/−小鼠,因此不进行密度测定*P(P)< 0.05.重量。
图7。
图7。
通过NFκB的p50和p65亚单位在骨骼肌中的核定位来评估NFκ)B的活化同步TgSod1−/−老鼠。A类)Ponceau S染色用于确保样品的等效负载,与面板中的Western印迹相对应B类,C、B,C类)NFκB p50的代表性蛋白印迹(B类)和p65(C类)骨骼肌细胞核组分中的亚基草皮1−/−、重量和同步TgSod1−/−小鼠和斑点密度定量*P(P)< 0.05.重量。
图8。
图8。
NMJ的结构和功能同步TgSod1−/−老鼠。A类)WT AT肌NMJ免疫荧光图像,同步TgSod1−/−,以及草皮1−/−8-12个月龄的小鼠。上图:突触前运动神经元的形态学,染色有神经丝和突触结合蛋白-2的抗体(绿色)。中间面板:用AlexaFluor 594-结合的银环蛇毒素(红色)标记的突触后AChR的形态。底部面板:突触前运动神经元和AChR的合并图像。比例尺=10μm。B类)WT骨骼肌AChR-αmRNA的表达(n个=9),草皮1−/−(n个=8),以及同步TgSod1−/−(n个=6)以γ-肌动蛋白为参考基因,通过实时PCR分析测定小鼠。数据归一化为WT值,并表示为折叠变化。C类)WT和EDL肌肉中诱发EPP和自发mEPP的代表性记录同步TgSod1−/−老鼠。D类)骨骼肌(GTN)中神经传递的变化,显示为使用WT的肌电图测量的肌肉CMAP的百分比减少(n个=9),同步TgSod1−/−(n个=9),以及草皮1−/−(n个=10)只小鼠*P(P)< 0.05.重量。

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