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.2014年2月；6(2):278-94.
doi:10.1002/emmm.201303373。 Epub 2013年12月27日。

侵袭性乳腺癌中ADAM8的表达促进肿瘤扩散和转移

马蒂尔德·罗马诺利 1, 诺拉·德米尼娃, 迈克尔·波美尔, 凯瑟琳娜·康拉德, 斯里马蒂·斯里尼瓦桑, 戴尔芬·劳松, 苏菲·巴里莱-尼翁, 艾琳·乔治库迪, 安妮·达格, 恩达·W·麦克德莫特, 迈克尔·J·达菲, 帕特里夏·M·麦高文, 乌韦·施洛曼, 麦迪·帕森斯, Jörg W Bartsch公司, 盖尔·索伦申
附属公司

侵袭性乳腺癌中ADAM8的表达促进肿瘤扩散和转移

马蒂尔德·罗马诺利等。 EMBO分子医学. 2014年2月.

摘要

跨膜金属蛋白酶双整合素ADAM8介导配体、受体和细胞外基质成分的细胞粘附和脱落。在这里，我们报告了ADAM8在乳腺肿瘤和衍生转移瘤中的大量表达，与正常组织相比，尤其是在三阴性乳腺癌（TNBCs）中。此外，高ADAM8水平预测患者预后较差。一直以来，ADAM8在培养中促进了TNBC细胞的侵袭性表型。在小鼠原位模型中，来自ADAM8基因敲除的TNBC细胞的肿瘤无法生长到可触及的大小，并且显示出血管化不良。循环肿瘤细胞和脑转移也显著减少。从机制上讲，ADAM8通过释放VEGF-A刺激血管生成，通过β1-整合素激活刺激内皮细胞迁移。在体内，用细胞接种时产生的抗ADAM8抗体治疗可减少原发性肿瘤负担和转移。此外，在切除模型中，抗体治疗已建立的肿瘤大大减少了转移。作为生理条件下的一种非必需蛋白，ADAM8是治疗TNBC的一个很有希望的新靶点，目前TNBC缺乏靶向治疗，并且经常会出现致命传播。

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数字

图1
图1
A类ADAM8公司使用Oncomine微阵列数据库分析乳腺肿瘤和正常乳腺组织样本中的mRNA表达。从六个不同的微阵列研究中收集14个分析结果表明ADAM8公司是乳腺癌组织中比正常组织中表达更高的基因之一。P（P）=0.025，学生的t吨-测试。B、 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测邻近正常乳腺组织（NBT）、纤维腺瘤（FA）和原发性乳腺癌（PBC）标本以及良性或恶性乳腺疾病（C）患者血清中的C ADAM8蛋白水平*P（P）<0.0001，Kruskal–Wallis检验（B）*P（P）=0.034，曼·惠特尼U型-测试（C）。D类ADAM8公司在van de Vijver微阵列数据集中分析了不同分子乳腺癌亚型的mRNA表达，其中包括295例原发性乳腺癌，分别来自正常型（normal-like）、管腔A（Lum A）、管腔内B（Lum B）、HER2和基底型（basal）亚型（van de Vijver等, 2002). *P（P）<Basal组与其他组的0.0001，Kruskal–Wallis检验。E通过免疫组化分析50例患者或微侵袭区邻近正常上皮组织和原发性TNBC样本中ADAM8染色的代表性图片。给出了ADAM8阳性样本的百分比。F、 G Kaplan–Meier曲线显示了295名原发性乳腺癌患者的无病生存率（F）和总生存率（G）的百分比，根据ADAM8公司mRNA水平使用第75百分位。P（P）<0.0001，对数秩和检验（RR，相对风险，CI，置信区间）。
图2
图2
ADAM8蛋白的示意图及其结构域、加工形式和分子量。富含CYS：富含半胱氨酸，EGF：类EGF，TM：跨膜结构域。B用WB检测人类非肿瘤MCF-10A细胞和所示TNBC细胞系的全细胞提取物（WCEs）的ADAM8表达（Millipore抗体）和β-肌动蛋白作为负荷对照。显示了一个具有代表性的污点(n个= 3). 所有车道均来自相同的凝胶，但按照垂直线所示进行切割以重新对齐。显示了ADAM8表格和MW标记。ns：非特异性带。MDA-231:MDA-MB-231。MDA-468:MDA-MB-468。C细胞在贴壁培养（2D）或超低贴壁培养板（3D）上悬浮培养48小时。在悬浮培养中，MDA-MB-231和Hs578T细胞形成球形。棒材：100μm。D、 E MDA-MB-231（D）和Hs578T（E）细胞转染控制siRNA（siCtrl）或两种特定的ADAM8公司siRNAs（siA8）24小时。然后将细胞接种在2D或3D培养基中，如（C）所述。WCE仅使用LSBio抗体（D）或同时使用LSBia和Millipore抗体（E）进行WB ADAM8测试。作为负荷控制，使用管蛋白（D）或β-肌动蛋白（E）。显示了具有代表性的斑点(n个= 3).
图3
图3
如图2D和E所示，用siRNAs转染A–D细胞24小时，并测试软琼脂（A）中的集落形成、细胞迁移（B）、侵袭（C）和3D-基质生长（D）。对于软琼脂分析，细胞生长8-12天，用ImageJ软件计算3个孔/条件中直径>20μm的菌落。显示了具有相似结果的两个实验的代表性*P（P）=0.002, **P（P）=1.9E-6，# P（P）=1.3E-5，## P（P）=1.0E-7，学生t吨-测试（A）。分别使用Transwells在无或有Matrigel预涂层的情况下进行24小时的迁移（B）和侵入（C）分析。控制条件（siCtrl）设置为100%（三个独立实验的平均值±标准差）*P（P）=0.004, **P（P）=5.3E-4，# P（P）=1.8E-4，## P（P）=5.5E-5，学生的t吨-测试（B）*P（P）=0.001**P（P）=9.3E-4，# P（P）=8.7E-6，## P（P）=4.6E-5，学生的t吨-测试（C）。对于Matrigel生长分析，在放大20倍的条件下拍摄5-7天后形成的菌落。实验进行了两次，结果相似。棒材：100μm（D）。E来自MDA-MB-231细胞的WCE和体内衍生的LM1和LM2株系，无论是未转染的（左面板）还是转染siCtrl或siA8 48小时的（右面板），均接受WB检测ADAM8（LSBio抗体）。显示了一个具有代表性的污点(n个= 3). F在siRNA转染后24小时，LM1和LM2细胞进行3D-基质生长试验，如（D）所示，但4天后拍摄菌落。实验进行了两次，结果相似。棒材：100μm。
图4
图4
对A–D稳定的ADAM8KD（shA8）克隆进行了表征在体外使用WB（LSBio抗体）（A）比较两个shA8克隆（shA8-17和shA8-20）和两个shCtrl克隆（shCtrl-3和shCtrl-5）的WCE中ADAM8的表达。克隆在2D培养基中培养48小时，并进行ATP检测。NS：不显著，学生t吨-测试，n个=3（B）。迁移分析如图3B所示*P（P）=6.8E-14，学生t吨-测试，n个=3（C）。如图3D所示，进行基质生长分析。实验进行了两次，结果相似。棒材：100μm（D）。将E–H MDA-MB-231衍生的shCtrl-3和shA8-20细胞注射到雌性小鼠的MFP中(n个=7/组）。每周测量两次肿瘤体积（平均值±标准偏差）*P（P）=1.4E-6**P（P）=9.8E-8，# P（P）=3.0E-5，## P（P）=9.7E-7，† P（P）=1.7E-5，‡ P（P）=5.1E-6，§ P（P）=2.0E-7，学生t吨-测试（E）。实验结束时，对肿瘤进行拍照并称重（平均值±标准偏差）*P（P）=5.6E-8，学生的t吨-测试。棒材：1厘米（F）。心脏穿刺采血，流式细胞仪检测GFP阳性CTC。每微升血液的平均CTC计数±标准日*P（P）=0.006，学生的t吨-测试（G）。用荧光显微镜检查脑转移(n个=6/组）。展示了代表性的照片。棒材：1 mm（H）。I ADAM8在乳腺癌远处转移中的表达(n个=56）进行免疫组织化学分析。给出了ADAM8阳性样品的代表性图片和百分比。
图5
图5
A电镀后16 h，细胞在常氧（−）或缺氧（+，1%O2）条件下培养24 h（MDA-MB-231和Hs578T）或6 h（shCtrl-3和shA8-20克隆）。WCE接受WB检测ADAM8（LSBio抗体）。显示了具有代表性的斑点(n个= 3). 用免疫组织化学方法分析小鼠乳腺肿瘤shCtrl-3或shA8-20细胞中B ADAM8的表达。H&E染色平行进行。显示了代表性面板(n个=7/组）。棒材：100μm。C通过shCtrl-3和shA8-20组肿瘤切片的CD31免疫组织化学染色来评估血管生成(n个=7/组）。每只小鼠的血管密度为2片/肿瘤（3个瘤周热点/幻灯片）中的平均血管数。P： 瘤周区，T：肿瘤。棒材：100μm*P（P）=0.01，学生t吨-测试。D Pearson的成对相关图显示ADAM8公司和CD31（PECAM1）基底样乳腺癌患者肿瘤中的mRNA表达（GenExMiner微阵列数据库）。r： 相关比。P（P）<0.0001，学生t吨-测试。E、 F HUVEC在存在来自所示shA8和shCtrl克隆的条件培养基的情况下进行试管形成分析，或在没有肿瘤细胞的情况下获得（−）。支点和闭合网络（多边形）的值为九个字段±s.d.的平均值。支点：*P（P）=1.3E-6与shCtrl-3*P（P）=3.2E-9与shCtrl-5**P（P）=6.9电子-29；多边形：*P（P）=5.2E-6与shCtrl-3*P（P）=1.3E-6与shCtrl-5**P（P）=6.2E-24；学生的t吨-测试；n个=4（E）。显示了4个独立实验的代表性图像。棒材：30μm（F）。G来自两个shCtrl和两个shA8克隆的条件培养基接受人类血管生成抗体阵列。使用ImageJ定量检测到的蛋白质的表达水平，shA8克隆中的血管生成介质显著下调2倍以上，表示为两个克隆的平均值±s.d.折叠变化（F.C.）和P（P）-给出了值，学生的t吨-测试。用WB分析shCtrl和shA8克隆的H条件无血清培养基中的VEGF-A(n个= 3). 通过WB（下面板）评估转染指定ADAM8形式或空载体（EV）DNA的shCtrl-3或shA8-20克隆的无血清条件培养基中的I VEGF-A。3个实验的平均水平量化表示为相对于设置为100%的shCtrl的百分比。
图6
图6
在肿瘤细胞植入MFP后的指定天数内，使用颌下腺下采集法从4只小鼠/组中抽取血液，并进行流式细胞术检测GFP阳性CTC。每个时间点每微升血液中4只小鼠的平均计数为±s.d*P（P）=0.03,# P（P）=0.05,† P（P）=0.02，学生t吨-测试。将B细胞在HUVEC单层或空孔中培养，一式两份。在每个孔的三个区域中对附着细胞进行计数。三个独立实验的平均值±标准差。NS，不显著*P（P）=1.6E-6，学生t吨-测试。C细胞在HUVEC上进行过夜内皮细胞迁移试验。三个独立实验的平均值±标准差*P（P）=1.7E-5，学生t吨-测试。D、 将E细胞涂布在纤维连接蛋白涂层的盖玻片上，用抗活性β1-整合素、管状蛋白或磷酸酪氨酸（局部粘连标记物）和卵磷脂-488（F-actin）抗体染色。共焦显微镜图像显示粘附蛋白通道（红色）或与F-actin融合（绿色）。棒材：10μm（D）。使用ImageJ软件（任意单位）测定活性β1-整合素和vinculin的信号强度。两次实验中20个以上细胞的平均强度±标准差*P（P）=1.4E-4，NS，不显著，学生t吨-测试（E）。F shCtrl-3细胞在HUVEC上的粘附性如（B）所示，之前用拮抗剂β1-整合素抗体（+）或对照同型（−）孵育shCtrl-3细胞。三个独立实验的平均值±标准差*P（P）=3.0E-5，学生t吨-测试。G、 HUVEC上shCtrl-3细胞的H粘附（G）和跨内皮细胞迁移（H）分别在B和C中进行评估。在检测之前，shCtrl-3细胞与靶向ADAM8外域的单克隆抗体（Mab10311或Mab1031）或适当的同型对照（分别为IgG1或IgG2B）孵育。在三个独立实验中进行了9小时的迁移试验，平均值±标准差*P（P）=0.001,# P（P）=5.0E-4，学生t吨-测试（G）*P（P）=6.3E-7，# P（P）=4.0E-7，学生版t吨-试验（H）。I通过免疫组织化学方法评估小鼠乳腺肿瘤（shCtrl-3和shA8-20）和对侧乳腺（shCtrl-2）中活性β1整合素的表达(n个=7/组）。P： 瘤周区，T：肿瘤。棒材：100μm。
图7
图7
将A–E MDA-MB-231 shCtrl-3细胞注射到雌性小鼠的MFP中。用0.5 mg/kg抗ADAM8（抗A8，Mab1031，n个=9）或同型匹配对照（IgG2B，n个=8）每周两次静脉注射。在指定日期测量肿瘤体积（平均值±标准偏差）*P（P）=0.02（第11天），# P（P）=0.01（第13天），† P（P）=2.1E-4（第17天），‡ P（P）=1.5E-4（第20天），学生的t吨-测试（A）。实验结束时，对肿瘤进行称重（平均值±标准偏差）*P（P）=5.8E-4，学生t吨-试验（B）和荧光显微镜（C）检查是否存在脑转移。肿瘤切片CD31免疫组化染色评价血管生成。每只小鼠的血管密度为2张幻灯片/肿瘤（5个瘤周热点/幻灯片）中的平均血管数，并显示了代表性图片（D）。P： 瘤周区，T：肿瘤。棒材：100μm。通过WB测定肿瘤提取物中的VEGF-A水平，并将其归一化为考马斯染色（E）*P（P）=0.04（D）*P（P）=0.03（E），学生的t吨-测试。F–G实验设计方案（F）。用荧光显微镜检查脑和肺的转移。代表性图像和转移频率（各组阳性动物的百分比：IgG2B，n个= 8; 抗A8，n个=9）表示（G）。棒材：250μm。
图8
图8
当实体瘤直径达到几毫米时，会诱导缺氧应激，导致ADAM8诱导产生强烈的促血管生成信号，部分是通过VEGF-a释放到细胞外室和内皮细胞募集。ADAM8还促进肿瘤细胞的β1-整合素活化，这些细胞需要粘附在血管壁上并通过血管壁迁移，从而支持CTC的传播和转移的发展。重要的是，这里我们证明，如果ADAM8的诱导被阻断或其活性被抗体抑制，则血管生成反应不足，导致肿瘤大量休眠或生长减缓，以及CTC和转移显著减少。
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