Effects of secreted factors in culture medium of annulus fibrosus cells on microvascular endothelial cells: elucidating the possible pathomechanisms of matrix degradation and nerve in-growth in disc degeneration

doi:10.1016/j.joca.2013.12.008

.2014年2月；22(2):344-54.

doi:10.1016/j.joca.2013.12.008。 Epub 2013年12月18日。

纤维环细胞培养液中分泌因子对微血管内皮细胞的影响：阐明椎间盘退变中基质降解和神经生长的可能病理机制

H J月亮¹, T尤鲁贝², T P洛齐托^三, P波尔⁴, R A哈特曼⁴, G A Sowa公司⁵, J D Kang博士⁶, 无价值价值⁷

附属机构

¹美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院矫形外科弗格森骨科研究实验室，邮编15261；韩国首尔韩国大学医学院神经外科。
²美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院矫形外科弗格森骨科研究实验室，邮编15261；神户大学医学研究生院矫形外科，神户650-0017，日本。
^三匹兹堡大学医学院细胞和分子工程中心骨科外科，地址：美国宾夕法尼亚州匹兹堡市科技大道450号，邮编：15219。
⁴美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院矫形外科弗格森骨科研究实验室，邮编15261。
⁵美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院矫形外科弗格森骨科研究实验室，邮编15261；匹兹堡大学物理医学与康复系，匹兹堡，宾夕法尼亚州15261，美国。
⁶美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院矫形外科弗格森骨科研究实验室，邮编15261。电子地址：kangjd@upmc.edu。
⁷美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院矫形外科弗格森骨科研究实验室，邮编15261。电子地址：von@upmc.edu。

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内政部： 2016年10月10日/j.joca.2013.12.008

纤维环细胞培养液中分泌因子对微血管内皮细胞的影响：阐明椎间盘退变中基质降解和神经生长的可能病理机制

H J月亮等。骨关节炎软骨. 2014年2月.

.2014年2月；22(2):344-54.

doi:10.1016/j.joca.2013.12.008。 Epub 2013年12月18日。

作者

H J月亮¹, T尤鲁比², T P洛齐托^三, P波尔⁴, R A哈特曼⁴, G A索瓦⁵, J D Kang博士⁶, 无价值价值⁷

附属机构

¹美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院矫形外科弗格森骨科研究实验室，邮编15261；韩国首尔韩国大学医学院神经外科。
²美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院矫形外科弗格森骨科研究实验室，邮编15261；神户大学医学研究生院矫形外科，神户650-0017，日本。
^三匹兹堡大学医学院细胞和分子工程中心骨科外科，地址：美国宾夕法尼亚州匹兹堡市科技大道450号，邮编：15219。
⁴美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院矫形外科弗格森骨科研究实验室，邮编15261。
⁵美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院矫形外科弗格森骨科研究实验室，邮编15261；匹兹堡大学物理医学与康复系，匹兹堡，宾夕法尼亚州15261，美国。
⁶美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院矫形外科弗格森骨科研究实验室，邮编15261。电子地址：kangjd@upmc.edu。
⁷美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院矫形外科弗格森骨科研究实验室，邮编15261。电子地址：von@upmc.edu。

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摘要

目标：测试纤维环细胞（AFCs）和内皮细胞（EC）之间的相互作用是否破坏基质稳态并刺激神经支配介质的产生。

方法：将人微血管内皮细胞培养在退化人手术标本AF细胞培养的条件培养基中。通过qRT-PCR、Western和免疫荧光分析该培养物内皮细胞的基质金属蛋白酶（MMPs）和血小板衍生生长因子（PDGF）。用ELISA法检测该细胞培养液中的血管内皮生长因子（VEGF）、白细胞介素-8（IL-8）和神经生长因子（NGF）。为了确定内皮细胞对AFC的影响，采用qRT-PCR测定在EC条件培养基中培养的AFC中胶原蛋白I、II和聚集蛋白聚糖的mRNA水平。

结果：与在原始培养基中培养的内皮细胞相比，暴露于AFC条件培养基中的内皮细胞表达了更高的侵袭性内皮细胞表型关键生物标志物的mRNA和蛋白水平，MMP-2（2×）、MMP-13（4×）、PDGF-B（1.5-2×）和NGF（24.9±15.2 pg/mL vs 0（原始培养基））。用EC培养条件培养基处理AF细胞可使II型胶原表达降低两倍。在未经处理的房颤细胞培养的条件培养基中也检测到大量的促血管生成因子IL-8（396.7±302.0 pg/mL）和VEGF（756.2±375.9 pg/mL）。

讨论：来自退变椎间盘的AFC分泌因子，刺激EC产生已知的诱导基质降解、血管生成和神经支配的因子。IL-8和VEGF可能是AFC分泌的因子，介导促血管生成刺激，常与椎间盘退变的发生有关。

关键词：血管生成；纤维环；内皮细胞；椎间盘退变；金属蛋白酶；尖端细胞。

爱思唯尔有限公司出版。

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数字

**图1。实验设计**
从AF培养物（STEP 1）收集的培养基在文中称为纤维环条件培养基（AFCM）。然后将HMEC-1细胞与AFCM培养48小时（STEP 2），以获得实验条件培养基（ExpCM）和实验内皮细胞（ExpEC）。对于对照组，HMEC-1细胞与原始培养基培养，以获得对照条件培养基（CtrCM）和对照内皮细胞（CtrEC）。ELISA法检测AFCM中的VEGF和IL-8。通过RT-PCR测定expEC和ctrEC的MMP和PDGF mRNA水平。用ELISA和Western检测了expCM和ctrCM中的MMP和PDGF蛋白。用免疫荧光法检测expEC和ctrEC的细胞内PDGF。对来自4名不同患者的独立样本进行测试，每个样本一式两份。数值代表4个独立实验的平均值（VEGF和IL-8测量值来自7个独立实验）±95%置信区间（95%CI）。

**图2。HMEC-1细胞的形态学特征**
在Matrigel（100倍放大）上的HMEC-1细胞培养中观察到毛细血管样结构的形成。在Matrigel上播种6小时后，细胞开始结合形成分支网络（B），这种情况持续（C-D）直到24小时，互连的加厚环网络完成。这些细胞形态是内皮细胞的特征。

**图3。HMEC-1对AF细胞基质基因表达的影响**
将AF细胞暴露于HMEC-1（ECCM）条件培养基或原始培养基中2天作为对照（a），并进行qRT-PCR以测量聚集蛋白、1型胶原和2型胶原的基质基因表达水平。与原始培养基相比，在ECCM中培养的AF表达较低的II型胶原mRNA水平（0.48x），而I型胶原和聚集蛋白mRNA水平在两组之间没有显著差异。数值为的平均值±95%CIn个=4. * :第页<0.05与CtrAF。

**图4。房颤细胞培养中VEGF和IL-8的产生**
在没有任何额外刺激的情况下，从退行性椎间盘组织中获得的AF细胞培养物表达并分泌了大量内皮细胞的关键促血管生成因子VEGF和IL-8。（A） ELISA法检测AFCM中的VEGF和IL-8。数值为的平均值±95%CIn个=7。（B）免疫荧光还显示VEGF在整个AF细胞中的细胞内分布。

**图5。AF细胞培养条件培养基对HMEC-1细胞PDGF表达的影响**
（A）与在原始培养基（CtrEC；白条）中培养的内皮细胞相比，在AFCM（ExpEC；灰条）中培育的内皮细胞在所有测试时间点表达的PDGF-B mRNA量显著较高。数值为的平均值±95%CIn个=4. *第页<0.05与CtrEC。（B） Western分析仅在ExpCM中检测到PDGF-B的分泌，而在AFCM或CtrCM中未检测到。(n个=4). （C）免疫荧光数据显示，在AFCM培养的HMEC-1中，凝集胞质PDGF-B定位于高尔基体*（底部面板）*对于胞吐释放的细胞外物质，在原始培养基中培养的HMEC-1显示PDGF-B的核染色*（顶部面板）*.

**图6。AF细胞培养条件培养基对HMEC-1细胞MMPs表达的影响**
（A） MMP mRNA的qRT-PCR测量。与暴露于原始培养基（CtrEC）的内皮细胞相比，暴露于AF条件培养基（ExpEC）的ECs细胞显著上调MMP-2和MMP-13，同时下调MMP-1 mRNA表达。两组间MMP-14 mRNA水平保持不变。数值为的平均值±95%CIn个=4. * :第页<0.05与CtrEC。（B）培养条件培养基中MMP蛋白的Western分析。Western结果证实了mRNA结果，与AFCM和CtrCM相比，ExpCM中MMP-2和MMP-13的分泌增强。ExpCM中的MMP-2不仅在总量上上调，而且主要以MMP-2的活性形式（66kDa）增加。与CtrEC相比，ExpEC中MMP-14蛋白没有显著变化。“相对表达式变化”表示与AFCM参考值相比的相对值，该参考值标准化为1。每个量化值的平均值为±95%CIn个=4. * :第页<0.05.

**图7。AF细胞培养条件培养基对HMEC-1细胞NGF表达的影响**
（A） ELISA分析显示，暴露于AF条件培养基（ExpCM）的内皮细胞以时间依赖性方式显著上调NGF。这与暴露于原始培养基（CtrCM）的内皮细胞培养基中检测不到的NGF水平形成对比。（B）免疫荧光分析显示，与单独培养HMEC-1（CtrEC）相比，AF条件培养基（ExpEC）处理的HMEC-1细胞内NGF增加。然而，CtrEC组中NGF免疫阳性细胞的存在表明HMEC-1在非刺激条件下表达但不分泌NGF。数值为的平均值±95%CIn个=4. *第页<0.05.

**图8。内皮细胞和房颤细胞旁分泌相互作用的示意性总结**
房颤细胞分泌因子，可能是IL-8和VEGF，它们上调关键MMPs（A）和NGF（C）的EC生成。NGF和MMP分别是神经生长和基质降解的重要介质。相反，内皮细胞分泌改变AF细胞基质基因表达的因子（B）。

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1. Miller JA，Schmatz C，Schultz AB。腰椎间盘退变：与600例尸检标本的年龄、性别和脊柱水平的相关性。脊柱（Phila Pa 1976）1988；13:173–8.-公共医学
1. Michalek AJ、Buckley MR、Bonassar LJ、Cohen I、Iatridis JC。动态剪切下椎间盘纤维环组织局部应变的测量：基质纤维取向和弹性蛋白含量的贡献。生物技术杂志。2009;42:2279–85.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Michalek AJ、Gardner-Morse MG、Iatridis JC。卸载状态下，椎间盘纤维环存在较大残余应变。生物技术杂志。2012-项目管理咨询公司-公共医学
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