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.2013年12月26日;5(6):1679-89.
doi:10.1016/j.celrep.2013.11.034。 Epub 2013年12月19日。

动态染色质修饰维持Snail-1诱导表达后的上皮-间充质转化

附属公司

动态染色质修饰维持Snail-1诱导表达后的上皮-间充质转化

莎拉·贾维德等。 单元格代表. .

摘要

上皮-间充质转化(EMT)被认为有助于肿瘤转移,但其潜在机制尚不清楚。为了确定这种细胞转化的早期步骤,我们分析了受EMT主调节因子蜗牛-1表达严格调控的人类乳腺上皮细胞。在蜗牛-1诱导后,上皮标记物在6小时内被抑制,间充质基因在24小时内被诱导。蜗牛-1与目标启动子的结合是短暂的(6-48小时),尽管持续的蛋白质表达,随后是短暂的和长期的染色质变化。对选定组蛋白乙酰化和去甲基化途径的药理学抑制抑制了蜗牛1介导的EMT的诱导和维持。因此,EMT涉及一种表观遗传开关,可以通过使用染色质修饰物的小分子抑制剂来防止或逆转。

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数字

图1
图1。蜗牛-1诱导的上皮和间充质基因表达
(A) ER-Snail-1感染MCF10A细胞的光镜图像S6A系列暴露于4-OHT 24、48和72小时后。(B)上皮(CDH1和CDH3)和间充质(FN1和SERPINE1)标记物的免疫印迹,以响应ER-Snail-1的4-OHT治疗S6A系列-转导细胞。β-actin起负荷控制作用。V表示父母未感染的MCF10A细胞。(C) 4-OHT介导的蜗牛-1诱导48小时后,上皮(CDH1和OCLDN)和间充质(CDH2、VIM、FN1、SERPINE1和CTGF)基因的mRNA表达(qRT-PCR)。误差条表示4-OHT 3、6、12、24、72和120小时后上皮(CDH1和OCLDN)和间充质(FN1和SERPINE1)基因的SEM(D)mRNA表达(qRT-PCR)。误差线代表SEM。(E)Snail-1表达后上皮(CDH1和OCLDN)和间充质(FN1和SERPINE1)基因表达的平均趋势线。(F) 无4-OHT(无OHT)、暴露于4-OHT后0小时(P0)和用4-OHT预处理48小时(P48)后,蜗牛-1转导的MCF10A细胞的实时细胞迁移(Roche-xCElligence系统)。另请参见图S1。
图2
图2。EMT急性诱导相关的动态基因表达模式
(A) MCF10A蜗牛-1诱导细胞基于微阵列的表达谱PCA图(时间点:3、6、12、24、72和120小时;每个时间点均归一化为其各自的对照(未处理)时间点)。(B) 簇I–III分别代表早期、晚期和暂时被抑制的基因。簇IV–VI分别是早期、晚期和瞬时诱导基因。黑色和红色线条分别代表未经处理的和蜗牛-1诱导的MCF10A细胞。(C) 通过基因集特征在单个基因表达簇中鉴定为富集的GSEA衍生途径。个别GSEA基因特征和分类如表S1–S6所示。另见表S7。
图3
图3。蜗牛-1与其靶基因启动子的瞬时结合
(A) 在添加4-OHT后的0、3、6、24、48、72和120小时,对CDH1和VIM启动子处的蜗牛-1与IgG对照进行ChIP-qPCR分析*p%0.001。误差条代表SEM。(B)ChIP-ChIP日志2添加4-OHT后0、6、48和120小时的蜗牛-1免疫沉淀比率。启动子序列在TSS的−2 kb到+2 kb范围内,这些序列适用于早期、晚期和短暂抑制基因(簇I–III)以及早期、晚期及短暂诱导基因(簇IV–VI)*p%0.05、**p%0.01和**p%0.001。红色、绿色和蓝色分别表示6、48和120小时,而0小时的时间点则表示120小时。(C) 蜗牛-1启动子结合与6小时时特定基因表达的相关性。基因根据表达水平(log2GE),蜗牛-1 ChIP-ChIP的平均值(对数2ChIP)启动子强度和每个bin的表达水平。Spearman p值显示在每个簇内(Nie等人,2012)。另请参见图S2和表S8。
图4
图4。与基因表达簇相关的瞬时和持续的蜗牛1诱导染色质标记
(A和B)ChIP-ChIP日志2与蜗牛-1诱导后0小时相比,蜗牛-1、H3K4Ac、H3K 27Ac、H 3K 4Me1、H 3K4Me2、H 3k 4Me3和H 3K 27Me3免疫沉淀物在6小时、48小时和120小时的热图。图中显示了表达被蜗牛-1改变的基因的−2 kb至+2 kb启动子区域的热图结果:早期(簇I)、晚期(簇II)和暂时(簇III)受抑制的转录物;以及早期(簇IV)、晚期(簇V)和瞬时(簇VI)诱导的转录物。参见图S3和S4。
图5
图5。染色质调节剂小分子抑制剂对EMT的抑制作用
(A) 在RNAi敲低HDAC1、HDAC2或HDAC3的细胞中,蜗牛-1诱导48小时后上皮(CDH1和OCLDN)和间充质(FN1和SERPINE1)基因表达的变化。在添加4-OHT之前24小时进行siRNA转染(参见图S5A中的数据)。误差条代表SEM。(B)用染色质调节剂小分子抑制剂处理细胞后,蜗牛-1诱导的上皮和间充质基因表达。在4-OHT治疗前24小时将药物添加到细胞中,并再维持48小时。误差条代表SEM。(C)染色质调节剂小分子抑制剂对TGF-β诱导的EMT的影响(48小时)。开始TGF-β治疗前24小时添加药物。误差线代表SEM。(D)选择性小分子抑制剂对蜗牛-1介导的EMT的影响。在4-OHT治疗前24小时将药物添加到细胞中,并再维持48小时。误差条代表SEM。(E)用小分子抑制剂处理细胞24小时,建立的蜗牛-1诱导EMT(用4-OHT 6天)的可逆性。误差条表示SEM用抑制剂治疗24小时后,已建立的TGF-β诱导的EMT(用TGF-β治疗12天)的可逆性。误差条代表SEM。另请参见图S5和S6。
图6
图6。小分子抑制剂对三阴性肿瘤细胞系间充质标记物和迁移的抑制作用
(A) 用小分子抑制剂治疗24小时后,已建立的癌细胞系(三阴性乳腺癌)中间充质标志物的可逆性。24小时后检测间充质(FN1、SERPINE1和VIM)基因的表达(Fluidigm qRT-PCR)。*p%0.05。每个药物治疗细胞系与对照DMSO治疗细胞系的骨髓间充质基因标记平均值的Student t检验(数据见图S6B和S6C)。(B) 有无TSA治疗(24小时)后HCC1937、MDA-MB-231和Hs578T的实时细胞迁移(Roche-xCElligence系统)。由于影响最小,因此未显示BT549和MDA-MB-468的迁移。另请参见图S6。

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    1. Abell AN、Jordan NV、Huang W、Prat A、Midland AA、Johnson NL、Granger DA、Mieczkowski PA、Perou CM、Gomez SM等。MAP3K4/CBP调节的H2B乙酰化控制滋养层干细胞中的上皮-间质转化。细胞干细胞。2011;8:525–537.-项目管理咨询公司-公共医学
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