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.2014年2月；10(2):243-56.
doi:10.4161/auto.27004。 Epub 2013年11月26日。

自噬激活减少尿蛋白引起的肾小管损伤

刘伟静 1, 米娜罗 1, 金谭 1, 魏晨 1, 黄磊照 1, 陈阳 1, 潘庆军 1, 李本一（Benyi Li） 2, 刘华凤 1
附属公司

自噬激活减少尿蛋白引起的肾小管损伤

刘伟静等。 自噬. 2014年2月.

摘要

自噬被证明对肾毒性药物引起的肾小管损伤是有益的。为了研究自噬是否能够保护肾小管上皮细胞（TEC）免受尿蛋白诱导的损伤，我们在体内外研究了尿蛋白超负荷后TEC自噬的活性和作用。我们发现，微小变化肾病综合征（MCNS）患者和阳离子BSA诱导的严重蛋白尿大鼠模型的TEC中的自噬空泡增加，接触从MCNS患者提取的尿蛋白导致自噬体和自溶体形成显著增加，SQSTM1/p62蛋白水平下降。尿蛋白的添加还可诱导LC3-II的溶酶体周转和溶酶体的核周聚集。这些变化是由活性氧（ROS）依赖机制介导的。此外，雷帕霉素预处理HK-2细胞可降低LCN2/NGAL和HAVCR1/KIM-1的生成，以及尿蛋白诱导的凋亡水平。相反，用氯喹或BECN1 siRNA阻断自噬则产生相反的效果。雷帕霉素和氯喹治疗后，在蛋白尿动物模型中也观察到类似的结果。综上所述，我们的结果表明自噬流量增加，在尿蛋白超负荷后TEC中产生适应性反应。

关键词：细胞凋亡；自噬激活；自噬途径；肾小管上皮细胞；尿蛋白。

PubMed免责声明

数字

无
图1。MCNS患者TECs自噬液泡的定量变化。(A和B)MCNS患者或对照组肾小管LC3免疫荧光染色和LC3-II表达评分。比例尺：50μm。(C和D)MCNS患者和对照组自噬空泡的超微结构图像。TEM图像显示具有代表性的初始/早期自噬体（AP）和降解/晚期自溶体（AL）(C类). MCNS患者TEC中的自噬空泡比对照组多(D类). 红色箭头表示自噬液泡。比例尺：500 nm(C类)和2μm(D类)分别是**P（P）< 0.01.
无
图2。尿蛋白暴露后HK-2细胞自噬空泡和自噬底物的变化。(A和B)不同浓度尿蛋白（UP）或白蛋白（ALB）暴露8h后，LC3-II（绿色）的免疫荧光染色和定量变化。细胞核被DAPI（蓝色）反染。比例尺：10μm。(C类)在透射电镜（TEM）下，HK-2细胞在8小时暴露于溶媒或8 mg/ml UP后自噬空泡的定量变化。高倍镜下显示AP和AL的典型图像。比例尺：500 nm。(D类)暴露于不同浓度的UP 8 h后，对LC3或SQSTM1水平进行Western blot分析。进行密度测定以进行定量，并将LC3-II或SQST M1与微管蛋白的比率表示为对照的倍数。(E类)暴露于不同浓度的ALB 8 h后，对LC3或SQSTM1水平进行Western blot分析。进行密度测定以进行定量，并将LC3-II或SQST M1与微管蛋白的比率表示为对照的倍数。(F类)暴露于8 mg/ml UP后不同时间点LC3水平的Western blot分析。(G公司)用LPS（0.025和0.5 EU/ml）或UP（8 mg/ml）治疗8 h后LC3水平的Western blot分析*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01和***P（P）< 0.001.
无
图3。尿蛋白暴露后HK-2细胞自噬体和自溶体的定量变化。(A类)荧光显微镜分析转染含有LC3融合串联mRFP-GFP标签（tfLC3）的质粒构建物的HK-2细胞，该质粒构建物经载体、尿蛋白（UP，8 mg/ml）、UP（8mg/ml）加氯喹（CQ，10µM）处理8 h。黄色斑点表示自噬体（箭头）。自由红色的点表示自溶体（箭头）。比例尺：10μm。(B)每个细胞的绿色或红色斑点的定量数据。(C类)每个细胞中黄色斑点或游离红色斑点的定量数据*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01和***P（P）< 0.001.
无
图4。雷帕霉素或氯喹对尿蛋白暴露后HK-2细胞自噬活性的影响。(A类)暴露于载体蛋白和尿蛋白（UP，8 mg/ml）、含有或不含雷帕霉素（RAP，10µM）或氯喹（CQ，10μM）8小时后，对HK-2细胞中的LC3-II（绿色）和LAMP2（红色）进行免疫荧光染色。比例尺：10μM。(B)按下述方法处理的HK-2细胞中LC3-II点的定量数据(A类). (C类)用Western blot分析处理的HK-2细胞中LC3、SQSTM1或LAMP2水平(A类). 进行密度测定以进行定量，LC3-II、SQSTM1或LAMP2与微管蛋白的比值表示为对照的倍数*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01和***P（P）< 0.001.
无
图5。尿蛋白对ROS产生、蛋白酶体活性和BECN1公司在HK-2细胞中表达。(A类)流式细胞仪分析不同浓度尿蛋白（UP，8mg/ml）处理后HK-2细胞中的ROS水平。(B)暴露于含或不含MG132（40µM）的载体和尿蛋白（UP，8 mg/ml）8小时后，HK-2细胞中26S复合体的不同蛋白酶体亚单位的活性(C和D)暴露于载体或尿蛋白（UP，8 mg/ml）、含或不含替龙（5 mM）或过氧化氢酶（CAT，2000 U/ml）8 h后，HK-2细胞中LC3-II（绿色）的免疫荧光。细胞核被DAPI（蓝色）反染。比例尺：10μm。(E类)LC3或贝克1HK-2细胞中的水平(C类). 进行密度测定以量化LC3-II或BECN1公司totubulin表达为对照组的倍数。(F类)用Western blot分析作为免疫抑制剂处理的HK-2细胞中LC3或SQSTM1水平(B). 进行密度测定以进行定量，并将LC3-II或SQSTM1与微管蛋白的比率表示为对照的倍数*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01和***P（P）< 0.001.
无
图6。雷帕霉素和氯喹对尿蛋白诱导的HK-2细胞损伤的影响。(A和B)暴露于载体、尿蛋白（UP，8 mg/ml）、UP（8 mg/ml）+雷帕霉素（RAP，10µM）或UP（8mg/ml）+氯喹（CQ，10μM）8小时后，TUNEL评估HK2细胞的凋亡。比例尺：100μM。(C和D)上清液LCN2和HAVCR1的水平通过ELISA测量，如(A类). (E类)通过MTT分析评估细胞活力，如(A类). *P（P）<0.05和**P（P）< 0.01.
无
图7。的影响BECN1公司沉默尿蛋白诱导的HK-2细胞损伤。(A类)蛋白质印迹分析BECN1公司或转染阴性对照后的LC3-II水平，或BECN1公司siRNA。(B)TUNEL检测HK-2细胞暴露于载体、尿蛋白（UP，8 mg/ml）、UP（8 mg/ml，加雷帕霉素（RAP，10µM）或UP（8mg/ml）加氯喹（CQ，10μM）8h后的凋亡情况(C和D)用ELISA法测定细胞培养上清液中LCN2和HAVCR1的水平，如(B).（E）)细胞活力通过MTT测定法进行评估，如(B). *P（P）<0.05和**P（P）< 0.01.
无
图8。雷帕霉素和氯喹对蛋白尿大鼠模型TEC自噬活性的不同影响(A类)对照组和蛋白尿模型大鼠肾组织中LC3的免疫组织化学染色，这些大鼠接受或不接受雷帕霉素（RAP）或氯喹（CQ）治疗。比例尺：50μm。(B)LC3、SQSTM1或BECN1公司用或不用RAP或CQ治疗的对照和模型大鼠的TECs水平。进行密度测定以定量和LC3、SQSTM1或BECN1公司totubulin表达为对照组的倍数*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01和***P（P）< 0.001.
无
图9。雷帕霉素或氯喹对蛋白尿大鼠TEC损伤的影响(A类)对照组和经或不经雷帕霉素（RAP）或氯喹（CQ）治疗的蛋白尿模型大鼠的PASM染色肾小管的代表性显微照片。比例尺：50μm。(B和C)TUNEL检测对照组和模型大鼠肾小管中TECs的凋亡(A类). (D和E)用ELISA法测定对照组和模型大鼠尿中LCN2和HAVCR1的水平(A类). (F类)用比色法测定对照组和模型大鼠的尿LDH水平(A类). *P（P）<0.05和**P（P）< 0.01.
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