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.2013年12月17:10:155。
doi:10.1186/1742-2094-10-155。

脑损伤后NADPH氧化酶（NOX）等型的细胞和时间表达

肖恩·库尼, Sara L Bermudez-Sabogal公司, 金伯利·R·伯恩斯 1
附属公司

脑损伤后NADPH氧化酶（NOX）等型的细胞和时间表达

肖恩·库尼等。 J神经炎症. .

摘要

背景：脑损伤导致产生NADPH氧化酶（NOX）的活性氧活性增加。初步研究表明，NOX2、NOX3和NOX4是大脑中最显著表达的NOX同型。然而，目前尚不清楚这些同型蛋白在受伤和未受伤大脑中的细胞和时间表达情况。

方法：在大鼠控制性皮质撞击诱导的脑损伤或损伤后的急性（24小时）、亚急性（7天）和慢性（28天）时间点，对NOX等型和脑细胞类型进行双重免疫荧光。

结果：发现NOX2、NOX3和NOX4等型在神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中表达，这种表达依赖于细胞来源和损伤后时间。NOX4存在于所有评估的细胞类型中，而NOX3仅在神经元中阳性，NOX2存在于小胶质细胞和神经元中。NOX2对损伤最敏感，主要在小胶质细胞中增加，以应对损伤。对该同型的量化显示，24小时NOX2表达显著增加，伤后7天和28天表达减少，尽管在以后的时间点表达仍高于假阳性水平。使用纯化的原代或细胞系培养进行细胞确认，在小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元中显示出类似的模式。此外，抑制NOX，尤其是NOX2，会降低小胶质细胞的促炎活性，这表明NOX不仅在刺激后上调，而且可能在损伤后神经炎症中发挥重要作用。

结论：这项研究阐明了脑损伤后NOX同工酶的表达谱，并表明NOX2，以及在较小程度上，NOX4，可能是创伤性脑损伤后急性观察到的大多数氧化应激的原因。这些数据可以为未来治疗方法的设计提供见解。

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数字

图1
图1
H&E组织染色显示随着时间的推移，病变发生了稳定的演变。损伤部位（虚线圆圈）可在损伤后24小时、7天和28天观察到。病变部位周围5mm段内的图像具有代表性。酒吧 = 2.5毫米。
图2
图2
损伤部位同侧小胶质细胞NOX2阳性。在损伤后24小时、7天和28天，用CD11b（绿色）标记小胶质细胞，并用抗NOX2（红色）抗体进行免疫染色。共标记单元格用箭头表示。数量2+伤后24小时细胞增多，伤后7天细胞进一步增多，但伤后28天染色类似假阳性。酒吧 = 20微米（A、B、D）; 50微米（C）.
图3
图3
损伤部位同侧NOX2表达显著增加。在中度脑损伤后24小时、7天和28天，在幼稚/假动物和动物的组织切片上进行NOX2的免疫荧光检测。采用染色强度阈值进行密度分析，从损伤部位中线到边缘测量蛋白质表达。NOX2染色在损伤后24小时增加，在损伤后7天和28天减少，尽管在28天时仍明显大于幼稚/假手术。点表示单个测量；平均值和SD的直线*P（P）与天真/虚假相比，<0.05。
图4
图4
小胶质细胞为NOX4+受伤部位的同侧。在幼稚动物中，用小胶质细胞标记物CD11b（绿色）标记的细胞不呈NOX4（红色）阳性。损伤后24小时和7天，一些CD11b阳性的细胞也呈NOX4阳性（箭头所示）。受伤后7天，所有CD11b+损伤部位的细胞NOX4阳性。28天时，并非所有CD11b+细胞为NOX4+.Bar（条形图） = 50微米。
图5
图5
小胶质细胞表达NOX2、NOX3和NOX4在体外.LPS刺激后，NOX2的分布改变到细胞核周围。相反，随着LPS刺激，NOX3染色消失，NOX4染色强度增加。用NOX2和NOX4染色的小胶质细胞刺激24小时，用NOX3染色的小神经胶质细胞刺激2小时。对于NOX2，bar = 20微米。对于NOX3和NOX4，bar = 50微米。
图6
图6
损伤部位同侧大脑中的神经元表达NOX2。在损伤后24小时和28天，幼稚组织中NeuN阳性的细胞NOX2也阳性，但在损伤后7天则不阳性。箭头表示双标记单元格。酒吧 = 20μm（初始，24小时）；50μm（7天，28天）。
图7
图7
损伤部位同侧大脑中的神经元NOX4阳性。NeuN公司+在损伤后24小时和28天，用NOX4（红色）对假损伤大脑中的（绿色）细胞进行免疫标记，但在损伤后7天，没有进行标记。箭头表示双标记单元格。酒吧 = 50μm（假手术和7天）；20μm（24小时）。
图8
图8
PC12神经元样细胞NOX2、NOX3和NOX4体外试验。PC12细胞在来自对照组或LPS刺激的小胶质细胞的条件培养基中培养2小时（NOX2）或24小时（NOX4）。加入LPS刺激的小胶质细胞培养基后，NOX2染色强度保持不变，但神经元中NOX4的强度降低。酒吧 = 20μm（NOX2）；50微米（NOX4）。
图9
图9
损伤部位同侧大脑中的星形胶质细胞NOX4阳性。GFAP公司+在假损伤脑内或损伤后7天，（绿色）细胞没有用NOX4（红色）进行免疫标记，但在损伤后24小时和28天观察到（红色）细胞。箭头表示双标签单元格，显示为黄色（最右侧的面板）。Bar=50μm（假手术和7天）；20μm（24小时28天）。
图10
图10
星形胶质细胞NOX2（A）和NOX4（B）阳性体外试验。在LPS刺激或不刺激的情况下培养星形胶质细胞24小时。NOX2和NOX4的星形胶质细胞表达不随LPS刺激而改变（A、B）.Bar（条形图） = 50微米。
图11
图11
抑制NOX可减少小胶质细胞的激活和毒性。与PMA或LPS孵育的BV2小胶质细胞显示ROS生成增加（A）预先注入NOX2特异性抑制剂gp91ds-tat（10μM）或NOX非特异性抑制剂DPI（10μM），分别显著降低PMA和LPS诱导的ROS生成（A）LPS还诱导NO•由BV2细胞释放，gp91-ds-tat（10μM）和DPI以剂量依赖的方式抑制释放（B）通过LDH释放测量，少突胶质细胞与LPS刺激的BV2细胞共培养24小时导致少突胶质细胞死亡显著增加（C）在LPS给药前，用DPI（10μM）预处理BV2细胞1小时，可阻断这种毒性作用。条形代表平均值 ± 标准偏差*P（P）<0.05; **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001.
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