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.2014年5月1日；23(9):2428-39.
doi:10.1093/hmg/ddt638。 Epub 2013年12月13日。

肾细胞癌中肿瘤易感基因TMEM127突变并调节溶酶体功能

Y秦 1, Y邓, C J Ricketts公司, 斯里坎丹省, E王, E R马赫, P L M Dahia公司
附属公司

肾细胞癌中肿瘤易感基因TMEM127突变并调节溶酶体功能

Y秦等。 人类分子遗传学. .

摘要

TMEM127是嗜铬细胞瘤中的一个与内体相关的抑癌基因，嗜铬细胞癌是一种可与肾细胞癌（RCC）共存的神经内分泌肿瘤。TMEM127丢失导致mTOR信号增加。然而，TMEM127突变的肿瘤谱以及TMEM127和mTOR在肿瘤发生中如何相互作用尚不清楚。在这里，我们报道生殖系TMEM127突变发生在RCC中，并且一些突变蛋白与野生型（WT）TMEM127-不同，不能与激活的早期内体GTPase Rab5协同抑制mTOR信号。Tmem127-全鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）在组成性Rab5激活后生成早期到晚期杂交内体方面存在缺陷，这是WT修复的缺陷，但不是突变型Tmem127。这种内体功能障碍导致mTOR与Rab5阳性囊泡的共定位减少。相反，Tmem127-null MEF中活性溶酶体结合mTOR增加，也显示溶酶体生物发生增强。我们的数据将TMEM127的抑瘤特性映射到内溶酶体mTOR功能的调节，这一特征可能有助于嗜铬细胞瘤和肾细胞癌的发病机制。

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数字

图1。
图1。
肾细胞癌中的TMEM127突变。(A类)分配TMEM127型沿着TMEM127蛋白结构在四个RCC中发现突变；(B)这些患者的主要临床和遗传特征；(C类)实时PCR定量TMEM127型-突变体和四个非突变体RCC肿瘤。每个样品在两个单独的实验中一式三份。将各组的结果合并为平均值±SEM；(D类)四个TMEM127突变体和转染HeLa细胞的WT-GFP融合构建物的细胞内分布模式显示为共焦显微镜下至少五个独立实验得出的弥散细胞质定位分数，每个构建物平均计数220个细胞(*对< 0.05).
图2。
图2。
TMEM127突变体与早期内体的结合减少。(A类)GFP融合构建物的共焦显微镜对四个突变体或WT TMEM127（绿色）与早期内体标记物EEA1（红色）共同染色的每个突变体进行编码。合并后的图像显示为黄色，细胞核为DAPI染色（蓝色）。比例尺为10µm。(B)（a）中所示的每个结构与EEA1或Rab5的共定位程度（图补充材料，图S1). 对至少三个独立实验的数据进行量化，每个构建体至少分析14个细胞(*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01). (C类)HA-TMEM127（绿色）与标记的Rab5共同转染构建WT、Q79L或S34N（红色），并用内源性EEA1（品红色）染色。合并的信号以白色显示。Rab5-Q79L的表达增加了TMEM127与早期内体标记物EEA1的共定位，而Rab5S34N的表达减少了TMEM129与早期内体标记物的共定位。注意底部面板上Rab5阳性结构中缺乏EEA1染色，表明Rab5S34N转染细胞的早期内体组装功能异常。比例尺为5µm。
图3。
图3。
TMEM127增强Rab5对mTOR信号的抑制。(A类)表达Flag-Rab5 WT、Q79L或S34N和HA-TMEM127或HA-EV构建物的293T细胞的裂解物用Flag抗体进行免疫沉淀（IP），并用TMEM127抗体进行免疫学印迹。用Flag（对于Rab5结构体）、TMEM127或β-actin作为加载控制进行探测后显示输入裂解物。(B)用内源性TMEM127多克隆抗体对表达所示Flag-Rab5结构体或空载体的293T细胞的裂解液进行免疫沉淀（IP），并用Flag抗体和β-肌动蛋白进行检测。(C类)293T细胞转染GFP-TMEM127、Flag-Rab5Q79L两种结构体或各自的空载体。在48小时时采集全细胞裂解物，进行蛋白质印迹，并用磷酸化（P）和总（T）mTOR靶点S6K、S6或4EBP1的抗体进行探测，以及GFP、Flag抗体和β-actin的抗体（星号表示非特异性带）。(D类)用空GFP-vector（EV）、GFP-TMEM127WT（WT）或四种RCC TMEM127突变中的每一种以及Rab5Q79L转染293T细胞，并在48 h后收获，用磷酸化（P）和总（T）S6K、S6、Flag、TMEM127和β-actin抗体检测印迹。(E类)通过图像J量化（d）中所示裂解产物中P/T S6的相对水平，并将其归一化为表达空载体（−）的细胞。
图4。
图4。
TMEM127缺失或缺失会降低Rab5激活的扩大囊泡表型。(A类)用Flag标记的Rab5Q79L转染表达两种独立TMEM127 siRNA（#2和#4）或对照siRNA（si-ctl）的HeLa细胞，并在24小时后固定用于染色和共聚焦显微镜。标记Rab5Q79L突变体显示为红色，DAPI染色的细胞核显示为蓝色。(B)对表达siTMEM127#2的HeLa细胞进行Rab5Q79L染色，无需（左）或转染对siRNA#2具有耐药性的TMEM127-构建物（WT-TMEM127SR）。(C类)来自Tmem127的MEF−/−或Tmem127+/+用Rab5Q79L和GFP空载体（左）、GFP-WT TMEM127（中）或GFP-Ser147del TMEM127（右）转染胚胎。(D类)指示了（C）中所示的每种细胞类型的每个细胞的扩增囊泡的数量的量化。数据来自至少三个独立实验(P（P）< 0.05; NS=不重要）。比例尺为10 mm。数据来自至少三个独立实验(P（P）< 0.05; NS=不重要）。比例尺为10µm。
图5。
图5。
Tmem127空MEF内源性内体标记的差异染色。Tmem127的共焦显微镜+/+或Tmem127−/−EEA1染色的MEF(A类)，拉布7(B)，灯2(C类)和RagC(D类)以红色显示。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺为10µm。(E类–H（H）)如图所示，从每个标记的两到四个独立实验中分析的20到40个细胞的每个内体标记的所示大小范围的点子的量化。数据绘制为平均值±SEM(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01).
图6。
图6。
在Tmem127 KO细胞中，mTOR与溶酶体结构域的结合增加。(A类)Western blot从两个独立的Tmem127 null（KO）或WT MEF裂解产物中检测磷酸化（P）或总（T）S6K、S6和4EBP1，以及Tmem127和β-actin。(B)WT（Tmem127）内源性mTOR染色（绿色）的共聚焦显微镜图像+/+)或KO（Tmem127−/−)转染Flag-Rab5Q79L（红色）的MEF，氨基酸剥夺50分钟后氨基酸暴露15分钟。合并的图像以黄色显示。比例尺为10µm。mTOR/Rab5Q79L共定位的定量显示在补充材料，图S6. (C类)KO或WT MEF在稳态培养条件下保持的内源性mTOR（绿色）、LAMP2（红色）和合并图像的共焦显微镜(补充材料，图S7a显示了共定位程度的量化）。比例尺为10µm；(D类)溶酶体基因空泡型ATP酶（vATPase）亚单位V1a、V1b2、V1d、V1g1、AP2的实时PCR定量及粘蛋白1基因编码(Mcoln1号机组)在MEF中。结果表示KO相对于WT MEF的折叠变化，这是由在独立的MEF对中进行的实验的三份数据（±SEM）生成的。(E类)两个独立的裂解产物的Western blotTmem127型KO或WT-MEF对，用LAMP2、TMEM127和β-actin探测。(F类)来自两个独立的MEF裂解物的Western blotTmem127型KO或WT-MEF对，用vATPase D1、TMEM127和β-actin探测。
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