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.2013年12月5日；4（12）：e949。
doi:10.1038/cddis.2013.471。

大麻二酚对线粒体外膜通道电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）的直接调节：大麻类药物诱导细胞死亡的新机制

N里默曼 1, D弯钩, Z波拉特, 一个侏儒, E科泽拉, M P丹尼尔斯, P S康奈利, E利什曼, H B布拉德肖, V肖珊·巴马茨, Z沃格尔
附属公司

大麻二酚对线粒体外膜通道电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）的直接调节：大麻类药物诱导细胞死亡的新机制

N里默曼等人。 细胞死亡病. .

摘要

大麻酚（CBD）是一种非精神活性植物大麻素，可抑制细胞增殖，诱导癌细胞死亡和激活免疫细胞。它不是经典CB1/CB2大麻素受体的激动剂，其作用机制尚不清楚。在这里，我们研究了CBD对BV-2小胶质细胞中各种线粒体功能的影响。我们的研究结果表明，CBD治疗导致细胞内钙水平的双相增加，线粒体功能和形态的改变导致细胞死亡。质谱和western blotting的密度梯度分馏分析显示，CBD与线粒体蛋白标记物共定位。线粒体外膜蛋白、电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）在细胞能量中的功能的单通道记录，代谢稳态和细胞凋亡表明，CBD显著降低了通道电导。最后，利用微尺度热泳，我们显示了纯化的荧光标记VDAC1和CBD之间的直接相互作用。因此，VDAC1似乎是CBD的一个新的线粒体靶点。CBD对VDAC1的抑制可能与CBD的免疫抑制和抗癌作用有关。

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数字

图1
图1
CBD诱导BV-2小胶质细胞死亡。(一)CBD剂量依赖性诱导BV-2细胞死亡 在无血清条件下进行h处理。细胞死亡被量化为亚G1期计数的增加百分比（100%=所有细胞周期阶段的总计数：亚G1、G1、S和G2/M）。与溶媒（0.1%乙醇）相比，SubG1计数的显著性。中央商务区5 μM、*对<0.001,n个=3; 中央商务区10 μM、，#对<0.001;n个=5，带Bonferroni的单向方差分析事后（post-hoc）). (b条)几种拮抗剂对CBD（10 μM） -诱导细胞死亡。预处理7.5 μM GW9662（GW；$对<0.01,n个=3，带LSD的单向方差分析事后（post-hoc）)并显著减弱5 μM ZM241385（ZM*对<0.002,n个=3，带LSD的单向方差分析事后（post-hoc）)到7 μM、 半胱氨酸A（CYSA；#对<0.001，n个=4，带LSD的单向方差分析事后（post-hoc）)，CBD诱导的细胞死亡不受0.5的影响 μM SR144528（SR；n个=6). 所有拮抗剂均溶解在二甲基亚砜中（最终浓度为0.1%）。(c（c）)中央商务区（10 μM） 用10 μM钌红（RR；#对<0.05,n个=3，带LSD的单向方差分析事后（post-hoc）), 10 μM路100635（路；#对<0.05,n个=3，带LSD的单向方差分析事后（post-hoc）). CBD诱导的细胞死亡不受100 纳克/毫升PTX(n个=3), 1 mM NAC公司(n个=5）或50 μM L名称(n个=3). 所有拮抗剂均用水稀释（不包括WAY100635，其在生理盐水中稀释）。(d日)胆固醇富集（50 μM、 芝麻油最终浓度0.1%）显著降低了CBD（10 μM） -诱导细胞死亡(#对<0.001,n个=3–5，带LSD的单向方差分析事后（post-hoc）). 在没有CBD的情况下，所有测试的化合物都不会导致细胞死亡
图2
图2
CBD引起线粒体肿胀。上面板：电子显微照片显示在2 无血清条件下CBD治疗h。高倍镜下的箭头显示了两个肿胀的线粒体，在这两个线粒体中仍然可以看到内膜和外膜。下面板：对照（载体处理）细胞显示线粒体的正常密度和形态。比例尺为2 μm和0.5 μ高放大率图像中的m
图3
图3
CBD诱导BV-2细胞内钙内流。(一)在无血清条件下，CBD剂量依赖性地诱导BV-2小胶质细胞内钙内流。钙的踪迹是三个独立实验的平均值(n个=每次实验15–30个单细胞）。(b条)CBD诱导的钙内流通过清除细胞外钙而减弱。钙的踪迹是三个独立实验的平均值(n个=每次实验15–30个单细胞）。(c（c）)具有代表性的轨迹（平均值n个=15个细胞），显示CBD对细胞内钙浓度的长期影响。CBD治疗导致细胞内钙短暂增加，随后钙显著增加
图4
图4
CBD导致线粒体膜电位损失并增加ROS生成。(一)CBD剂量依赖性降低线粒体膜电位（Δψ）（IC5010 μM） ●●●●。细胞用电位红色荧光染料TMRM染色。CCCP（50 μM） ，导致Δψ电位快速损失（TMRM荧光损失），用作计算CBD影响的控制。此处显示的ImageStream图像来自分布平均值。剂量-反应曲线是三个实验的代表。(b条)CBD剂量依赖性诱导ROS生成（EC504.9 μM） ●●●●。细胞与指定浓度的CBD或300 μM TBHP用作阳性对照，然后用羧基-H染色2DCFDA。图中显示的ImageStream图像来自分布平均值。剂量-反应曲线是三个实验的代表
图5
图5
CBD与富含VDAC1的线粒体膜共定位(一)细胞器被分成四个部分。每条车道装载等量的蛋白质。结果代表了两个独立的实验。蛋白质标记物在以下组分中的分布：粗线粒体（粗线粒体）、溶酶体和质膜（Lyso/PM）、内质网（ER）和胞浆（使用western blot分析）。(b条)使用LC/MS/MS对这些级分中的CBD浓度进行定量(c（c）)在连续OptiPrep/蔗糖膜密度梯度的各个级分中检测到的CBD浓度。CBD主要集中在组分6中，并与线粒体蛋白VDAC1共定位。数据代表三个独立实验
图6
图6
CBD与纯化的VDAC1相互作用，降低其通道电导。(一)VDAC1被重建为PLB和通道电流，以响应电压阶跃0至−10 毫伏（I）和0至−60 mV（II），在（对照）和15 添加20分钟后 μM中央商务区。显示了三个独立实验的代表。虚线表示零电流。(b条)CBD对VDAC1电导的影响作为电压的函数，从60 毫伏至−60 mV。将任何给定电压下的平均稳态电导归一化为10时的电导 mV。记录在（对照组）和15 添加CBD后min。(c（c）)CBD–VDAC1相互作用的热电泳分析。用热泳法（激光功率80%）测试荧光标记的纯化VDAC1和CBD（或内源性大麻素AEA）之间的相互作用。VDAC1和CBD（或AEA）孵化30–60 PBS中的min，以2%乙醇为载体。根据CBD或AEA浓度绘制荧光差异图。数据代表CBD的三个独立实验（其中两个重复）和AEA的两个重复独立实验的平均值
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